專利名稱：：預(yù)測動脈粥樣硬化和異常功能高密度脂蛋白的測定的制作方法預(yù)測動脈粥樣硬化和異常功能高密度脂蛋白的測定相關(guān)申請的交叉參考根據(jù)背景和環(huán)境，HDL可作為抗炎分子或促炎分子存在。兔和人中的急性期反應(yīng)(APR)可將HDL由抗炎形式轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺仔问?，即HDL失去其抗LDL誘導(dǎo)的炎癥的保護(hù)能力，實(shí)際上HDL以其促炎狀態(tài)促進(jìn)LDL誘導(dǎo)的炎癥。不囿于具體理論，一般認(rèn)為HDL在基礎(chǔ)條件下起抗炎作用，但在APR過程中，抗氧化酶活性喪失，apoA-I受損，與HDL結(jié)合的蛋白被置換和/或交換，產(chǎn)生促炎HDL。例如，業(yè)已表明，在遺傳上對動脈粥樣硬化易感的小鼠中致動脈粥樣硬化膳食將HDL由抗炎轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺?但在遺傳上抗動脈粥樣硬化的小鼠中不會如此)(Navab等，(1997)J.C//"./羅《99:2005-2019)。從那以后，幾個研究已表明了促炎HDL在動物模型中的存在情況和性質(zhì)(Castellani等，(1997)丄C//"./"ve就，100:464-474，綜述于Navab等，(2005)A/^/.'37:173-178)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法。該方法通常包括提供來自哺乳動物的生物樣品，其中所述樣品含有HDL;并檢測與HDL結(jié)合的2種以上、3種以上、或4種以上、或5種以上、6種以上、7種以上或8種不同的蛋白，其中所述蛋白選自m/z比率約9.3的蛋白、m/z比率約14.9的蛋白、m/z比率約15.6的蛋白、m/z比率約15.8的蛋白、m/z比率約16.2的蛋白、m/z比率約16.5的蛋白、m/z比率約18.6的蛋白和m/z比率約19.5的蛋白，其中檢測到兩種或更多種蛋白與HDL結(jié)合表明所述HDL為促炎HDL。在某些實(shí)施方案中，哺乳動物為非人哺乳動物或人(例如診斷為患有動脈粥樣硬化的人，或面臨動脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的人，或還提供在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法。在多個實(shí)施方案中，所述方法包括檢測哺乳動物中的一種或多種與HDL結(jié)合的、含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水平；檢測哺乳動物血漿(或血清)中的一種或多種所述含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水ii平，其中HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于1表示該哺乳動物的HDL為促炎HDL。在某些實(shí)施方案中，含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白包括選自以下的一種或多種蛋白血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、可溶性CD163和髓過氧物酶。在某些實(shí)施方案中，含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白包括結(jié)合珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中，對于2種以上、3種以上、4種以上、5種以上或6種蛋白而言，HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于1表示該哺乳動物的HDL為促炎HDL。在某些實(shí)施方案中，對于l、2、3、4、5或6種蛋白而言，HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于選自1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3和0.2的值，表示該哺乳動物的HDL為促炎HDL。在某些實(shí)施方案中，提供在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法，其中這些方法通常包括測定哺乳動物中的HDL的鐵含量，其中HDL的鐵含量水平相比于正常抗炎HDL的鐵含量升高表示該哺乳動物的HDL為促炎HDL。在某些實(shí)施方案中，升高的水平在等于或大于90%、95%、98%或99%的置信水平是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。還提供使用一氧化氮測定檢測或定量促炎HDL的方法。這些方法通常涉及HDL消耗一氧化氮的能力，其中HDL消耗一氧化氮的能力相比于正?？寡譎LD消耗一氧化氮的能力增強(qiáng)表示促炎HDL的存在情況、量或活性。在某些實(shí)施方案中，一氧化氮經(jīng)化學(xué)方法產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，一氧化氮通過電子信號檢測。在某些實(shí)施方案中，提供在哺乳動物中測定以炎癥反應(yīng)為特征的病癥的存在情況或易患病體質(zhì)的方法。該方法通常包括實(shí)施本文所述的任一種或多種測定，其中陽性測試結(jié)果說明存在所述病癥或?yàn)橐谆疾◇w質(zhì)。在多個實(shí)施方案中，所述病癥選自動脈粥樣硬化、中風(fēng)、麻風(fēng)、肺結(jié)核、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性多肌痛、結(jié)節(jié)性多動脈炎、硬皮病、特發(fā)性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、哮喘、阿爾茨海默氏病、慢性腎衰竭、糖尿病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性腎病、移植排斥、移沖直動脈粥樣硬化、缺血再灌注、成人呼吸系統(tǒng)綜合征、充血性心力衰竭、腎小球炎、代謝綜合征、多發(fā)性硬化、膿毒病綜合征、鐮狀細(xì)胞病、血管性癡呆、克羅恩氏病、內(nèi)皮功能障礙、小動脈功能障礙、AIDS、風(fēng)濕性多肌痛、結(jié)節(jié)性多動脈炎、硬皮病、特發(fā)性肺纖維化、冠狀動脈鈣化、鈣化性主動脈瓣膜狹窄(calcificaorticstenosis)、骨質(zhì)疏+〉、細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、自身免疫病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。還提供治療患有以炎癥反應(yīng)為特征的病癥的人或非人哺乳動物的方法。所述方法通常包括實(shí)施本文所述的任一種或多種測定，并為在測定中測試陽性的那些患者處方更積極的療法(例如給予他汀類藥物和/或如在美國專利7,166,578、7,148,197、7,144,862、6，933,279、6,930，085和6,664,230中所述的治療劑，所述專利在所有情況下都在此引入作為參考)。定義本文可使用以下的縮寫APR，急性期反應(yīng)；CAD,冠狀動脈病；HDL-C，HDL膽固醇；MM-LDL，輕度修飾的/氧化的LDL;PON，對氧-岸酶；ApoAl，載脂蛋白A1;叩oE,載脂蛋白E;CM10,弱陽離子芯片；CVD,心血管疾??；CHD,冠心??；FPLC,快速蛋白液相層析；Hb，血紅蛋白；Hb-a，血紅蛋白a鏈；Hb-p,血紅蛋白p鏈；Hp,結(jié)合珠蛋白；Hx,血紅素結(jié)合蛋白；HDL,高密度脂蛋白；HPLC,高效液相層析；LDL，低密度脂蛋白；LDLR，LDL受體；metHb,高鐵血紅蛋白；NP20芯片，正相芯片；oxyHb，氧合血紅蛋白；PON，對氧石粦酶；pHDL，后HDL級分；Q10芯片，強(qiáng)陰離子交換芯片；RBC,紅細(xì)胞；SELDI，表面增強(qiáng)激光解吸/離子化；SELDI-TOF-MS，表面增強(qiáng)激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜；^LC-MSMS，微量液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜；VLDL，極低密度脂蛋白。00271"免疫測定"是利用特異性結(jié)合分析物(例如結(jié)合珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白)的抗體的測定。免疫測定的特征在于使用特定抗體的特異性結(jié)合特性分離、靶向和/或定量分析物。術(shù)語"高密度脂蛋白"或"HDL"按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常用法來定義。一般而言，"HDL"是指脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物，其在通過超離心分離時以d=1.063至d-1.21的密度范圍存在。短語"由哺乳動物提供生物樣品"是指直接獲取樣品(例如血樣)或者獲得或提供已由另一方從哺乳動物獲取的生物樣品。附圖簡述圖2表明，攝食普通飼料的ApoE無效小鼠的HDL是促炎的，在口服D-4F治療后轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡椎?。在治療?第0天)和用載脂蛋白A-I模擬肽D-4F(50pg/mL飲用水)治療X軸所示天數(shù)后對攝食普通飼料的9月齡雌性apoE無效小鼠(每組n=4只小鼠)取血。測定apoE無效小鼠HDL抑制LDL加DCF的熒光的能力，作為其炎癥特性的檢測。數(shù)據(jù)表明，apoE無效小鼠HDL在治療前是促炎的((即額外的第0天apoE異常功能HDL將熒光增加至單獨(dú)的LDL誘導(dǎo)的熒光之上)，但在用D-4F治療后(第1-21天)變成抗炎的。00431圖3表明，在D-4F治療后血紅素結(jié)合蛋白的血清濃度降低。在以上圖2所述小鼠中的血紅素結(jié)合蛋白的血清濃度通過ELISA測定。圖5表明，D-4F治療降低apoE無效小鼠的HDL中的結(jié)合珠蛋白(Hp)和血紅素結(jié)合蛋白(Hx)。HDL分離自圖2中所述小鼠，并測定Hp、Hx和載脂蛋白A-I(ApoA-I)的含量。0046圖6表明，D-4F治療導(dǎo)致非變性PAGE凝膠上分子量類似于RBC中所含的血紅蛋白分子量的非RBC血紅蛋白增加。來自圖2中所述4只小鼠的每一只的治療前(第0天)和治療21天后(第21天)的血清、HDL和紅細(xì)胞(RBC)在非變性PAGE(4-15%)凝膠上進(jìn)行電泳，并通過蛋白質(zhì)分析來分析血紅蛋白。數(shù)據(jù)表明，在治療前，血清中和HDL上清液(其含有HDL和非脂蛋白級分)中的所有血紅蛋白都在非變性PAGE凝膠上以顯著高于裂解RBC的血紅蛋白的分子量的表觀分子量電泳。然而，在用D-4F治療21天后，在血清和HDL上清液中有顯著量的血紅蛋白在凝膠上以類似于裂解RBC的血紅蛋白的分子量的表觀分子量電泳。圖8表明，在攝食普通飼料達(dá)7天(D7C)或攝食致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天(D7A)或15周(W15A)的野生型C57BL/6J小鼠中測定HDL中的氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的含量。還在攝食普通飼料的apoE無效小鼠(叩oE)中測定氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的含量。如在圖中所示，在攝食致動脈粥樣硬化膳食的C57BL/6J小鼠和攝食普通飼料的apoE無效小鼠中，大部分結(jié)合HDL的血紅蛋白是氧合血紅蛋白。圖9表明，加入喂祠普通伺料達(dá)7天的野生型C57BL/6J小鼠(D7C)的HDL不消耗以化學(xué)方式(NO供體)產(chǎn)生并以電流(pA)檢測的一氧化氮。圖11表明，促炎HDL(來自攝食致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天的野生型C57BL/6J小鼠的HDL;D7AHDL)使一氧化氮衰變曲線快速急劇下降，表明促炎HDL快速消耗一氧化氮。然而，在用將HDL中的氧合血紅蛋白(HDL-HbO。轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白(HDL-metHb)的K3Fe(CN)6處理該HDL后，加入該HDL不能顯著改變衰變曲線，表明一氧化氮未被消耗。圖19顯示了來自C57BL/6J小鼠血清的HDL的炎癥特性。HDL用HDL試劑分離，并分析其活性氧含量(熒光強(qiáng)度)、對氧磷酶(PON)活性測定、膽固醇流出測定(％膽固醇流出)和膽固醇含量(HDL-膽固醇)。C-普通祠料，喂飼7天，A-致動脈粥樣硬化膳食，7天，AC-致動脈粥樣硬化膳食，7天，之后喂飼普通飼料14天。*代表p〈0.01。圖21圖解了代表m/z14.9k(血紅蛋白a鏈)和m/z15.6k(血紅蛋白P鏈)的峰的pl測定。采用為所示不同pH的緩沖液，利用陰離子交換離心柱，對喂飼普通飼料(C)或致動脈粥樣硬化膳食(A)達(dá)7天(D7)或15周(W15)的C57BL/6J小鼠(n=8)的個體血清樣品進(jìn)行脫鹽和分級分離。用陽離子交換(CM10:pI〉4)或陰離子交換(Q10:pl<4)ProteinChip陣列對洗脫的級分進(jìn)行SELDI分析。顯示了于14.9k和15.6k的相對密度。圖25表明，非RBC血紅蛋白與攝食致動脈粥樣硬化膳食的HDL級分結(jié)合(左圖)，類似于RBC血紅蛋白遷移的非RBC血紅蛋白在攝食致動脈粥樣硬化膳食15周后消失(右圖)。將來自喂飼普通飼料(C)或致動脈粥樣硬化膳食(A)達(dá)7天(D7)或15周(W15)的C57BL/6J小鼠(n-8)的合并的血清樣品(右圖)或來自D7的合并HDL級分(左圖)加載至非變性PAGE,并針對血紅蛋白進(jìn)行免疫印跡。又將來自攝食普通伺料的小鼠的RBC裂解物加載至凝膠上(左圖的最左圖26A和26B顯示了HDL中Hb的分光光度計(jì)測定結(jié)果。使用BeckmanDU640分光光度計(jì)，由含HDL的合并FPLC級分確定Hb的量和形式。掃描由380nm至700nm的所有樣品和純物質(zhì)的光譜(圖26A)。精胺氮氧化加合物(speraiineNONOate)是一種緩慢的時間釋放NO供體，將其加入樣品，以觀察oxyHb向metHb的轉(zhuǎn)變(圖26B,示意圖)。利用線性回歸將一組純物質(zhì)的"基礎(chǔ)光譜，，對檢測光譜擬合，去巻積oxyHb和metHb的濃度(Vaughn等，(2000)丄C7z，.，275:2342-2348)。圖28A、28B和28C證實(shí)，在青少年糖尿病和CHD患者的HDL中，非RBC血紅蛋白和結(jié)合珠蛋白均增加。由12名健康志愿者、14名青少年糖尿病患者(8名成人；6名兒童)或8名服用他汀類藥物的CHD或CHD等同疾病受試者收集血清。將針對人apoA-I的抗體包被在96孔板上。加入來自受試者的血清，并于4'C過夜溫育。徹底洗滌板，并與抗人血紅蛋白或人結(jié)合珠蛋白的山羊一抗于4。C過夜溫育。徹底洗滌板，并與綴合辣根過氧化物酶(HRP)的針對山羊IgG的二抗于室溫溫育2小時。徹底洗滌板，加入HRP底物，檢測光密度(OD)。圖28A以pgHRP/mL顯示非RBC血紅蛋白。圖28B以嗎HRP/mL顯示結(jié)合珠蛋白。圖28C顯示了非RBC血紅蛋白值乘以結(jié)合珠蛋白值的乘積。結(jié)果表明，后一方法獲得的值將健康志愿者與糖尿病患者和CHD患者區(qū)分開來，沒有任何重疊。I.HDL結(jié)合蛋白的檢測，其反映了HDL的炎癥性質(zhì)；和還令人驚奇的本發(fā)明發(fā)現(xiàn)是，在正常小鼠和正常人中，此少量的非RBC血紅蛋白位于血漿或血清的非脂蛋白級分中。還令人驚奇的本發(fā)明發(fā)現(xiàn)是，在攝食致動脈粥樣硬化膳食的小鼠中，或者在已進(jìn)行遺傳操作而出現(xiàn)動脈粥樣硬化的小鼠中，或者在糖尿病或CHD的病人中，或者在具有其它促炎HDL起因的人中，該非RBC血紅蛋白存在于HDL中。D-4F治療i)將HDL由促炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡?參見例如圖2),ii)根據(jù)ELISA檢測，顯著降低血清中的Hx(參見例如圖3)和Hp(參見例如圖4)水平，iii)降低HDL級分中的Hx和Hp蛋白復(fù)合物(參見例如圖5)，和iv)在apoE無效血清和apoE無效HDL上清液中的Hb部分恢復(fù)到正常(即在紅細(xì)胞中可見的)的物理和化學(xué)特性(參見例如圖6)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測與HDL結(jié)合的、為促28炎HDL組分的血紅素相關(guān)蛋白的方法。如在圖8中所示，在喂飼普通飼料7天(D7C)或喂飼致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天(D7A)或15周(W15A)的野生型C57BL/6J小鼠中確定HDL中的氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的含量。還在喂飼普通飼料的apoE無效小鼠(apoE)中確定氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白的含量。處理來自喂伺致動脈粥樣硬化膳食的d、鼠的促致動脈粥樣硬化的HDL逆轉(zhuǎn)促炎HDL快速消耗一氧化氮的能力。圖解于圖12-15的實(shí)驗(yàn)表明，血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白可位于致動脈粥樣硬化血清中的相同顆粒上。如在圖1中所示，對于致動脈粥樣硬化膳食，這些顆粒主要與HDL結(jié)合。喂飼對結(jié)合珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白無效的C57BL/6J小鼠致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天證實(shí)了結(jié)合珠蛋白在促炎HDL形成中的重要作用。簡而言之，對野生型(WT)或血紅素結(jié)合蛋白(Hx)無效或結(jié)合珠蛋白(Hp)無效或血紅素結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白(Hp/Hx)均無效的C57BL/6J小鼠喂飼普通祠料(C)或致動脈粥樣硬化膳食(A)達(dá)7天。對小鼠取血，測定它們血漿的FPLC級分中的膽固醇含量和血紅素含量。野生型HDL實(shí)際上沒有結(jié)合的血紅素。當(dāng)喂飼這些小鼠致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天時，存在與HDL級分結(jié)合的血紅素(下方圖的黃線)。在沒有血紅素結(jié)合蛋白時，即便攝食普通飼料也存在與HDL級分結(jié)合的血紅素，當(dāng)這些小鼠攝食致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天時，這些小鼠的HDL中的血紅素含量增加。相比之下，攝食致動脈粥樣硬化膳食的、沒有結(jié)合珠蛋白的小鼠不具有結(jié)合HDL的血紅素(右下圖綠線；右下圖紅線)。因此，結(jié)合珠蛋白是血紅素結(jié)合HDL所必需的。在另一個實(shí)驗(yàn)中，對野生型(WT)或血紅素結(jié)合蛋白(Hx)無效或結(jié)合珠蛋白(Hp)無效或血紅素結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白(Hp/Hx)均無效的C57BL/6J小鼠喂飼普通飼料或致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天。對小鼠取血，并測定它們血漿的FPLC級分中的膽固醇含量和活性氧物質(zhì)(ROS)含量。HDL實(shí)際上沒有結(jié)合的ROS。當(dāng)喂飼這些小鼠致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天時，存在與HDL級分結(jié)合的ROS。在沒有血紅素結(jié)合蛋白時，即便攝取普通祠料也存在與HDL級分結(jié)合的ROS,當(dāng)這些小鼠攝食致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天時，這些小鼠的HDL中30的ROS含量增加。相比之下，攝食致動脈粥樣硬化膳食的、沒有結(jié)合珠蛋白的小鼠不具有結(jié)合HDL的ROS。因此，結(jié)合珠蛋白是ROS結(jié)合HDL所必需的。在某些實(shí)施方案中，測定包括檢測與HDL結(jié)合的、含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白(例如血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶)的水平，并與HDL的非脂蛋白級分中的這些含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水平相比，其中升高的水平(例如與在保護(hù)性HDL中發(fā)現(xiàn)的水平相比)表明該HDL為促炎HDL。在多個實(shí)施方案中，測定包括測定與HDL結(jié)合的、含血紅素的蛋白(例如血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶)的水平對在血漿和/或血清的非脂蛋白級分中的這些含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水平的比率，其中至少1種、至少2種、至少3種或4種蛋白的比率大于或等于約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1的值表示該HDL為促炎HDL。要認(rèn)識到的是，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的測定通常在不同的診斷背景下進(jìn)行，所述診斷允許技術(shù)人員鑒定目標(biāo)對象中以炎癥反應(yīng)為特征的一種或多種特定病癥。IV.HDL結(jié)合蛋白的檢測/定量如上所示，在某些實(shí)施方案中，使用全血、血清或血漿進(jìn)行測定。獲得和儲存血液和/或血液制品是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。血液通常通過靜脈穿刺獲得。血液可加入本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的緩沖液或其它試劑進(jìn)行稀釋，并可于2-8。C儲存達(dá)24小時，或者于-20。C以下儲存更長時間，然后檢測。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在沒有防腐劑的情況下將血液或血液制品(例如血清)于-70。C長期儲存。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用眾多經(jīng)過充分驗(yàn)證的免疫結(jié)合測定中的任一種4全測和/或定量生物樣品中的蛋白(參見例如美國專利4,366,241、4,376,110、4,517,288、4,837,168、6,974,704、366,964,872、6,887,362、6,878,558、6,855,562、6,849,457、6,835,543、6,830,731、6,818,456、6,818,455、6,770,489、6，737,277、6,723,524、6,689,317、6,682,648、6,673,562、6,632,603等)。關(guān)于一般免疫測定的綜述，另參見A/eAo^fc/"Ce〃所o/ogyFb/wwe37:爿w"6o(i/esz力CW/Asai編輯，AcademicPress,Inc.NewYork(1993);5as7'cC7/mca〃www"o/ogv笫7版，Stites和Terr編輯，(1991)。0119免疫結(jié)合測定(或免疫測定)通常使用"捕獲物"來特異性結(jié)合并經(jīng)常固定分析物(在本案中為血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等，和/或其片段)。捕獲物是特異性結(jié)合分析物的部分。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲物是在本案中特異性結(jié)合血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等和/或其片段或同種型的抗體。能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其它蛋白，例如A37蛋白或G蛋白，也可以用作標(biāo)記物。這些蛋白是鏈球菌細(xì)胞壁的正常組分。它們與多個物種的免疫球蛋白恒定區(qū)具有強(qiáng)烈的非免疫原性反應(yīng)性(參見例如Kronval等，(1973)/./mmw"o/.,111:1401-1406;Akerst讓等,(1985),/扁,/.,135:2589-2542等)。在多個實(shí)施方案中，檢測或定量血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的免疫測定可為竟?fàn)幮缘幕蚍蔷範(fàn)幮约t蛋白，和/或結(jié)合珠蛋白，和/或血紅素結(jié)合蛋白，和/或髓過氧物酶等)的量的測定。在一個優(yōu)選的"夾心"測定中，例如，捕獲物(例如抗結(jié)合珠蛋白抗體，和/或抗血紅蛋白抗體，和/或抗血紅素結(jié)合蛋白抗體，和/或抗髓過氧物酶抗體)可直接結(jié)合固定它們的固體基質(zhì)。然后，這些固定化抗體捕獲測試樣品中存在的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白和/或髓過氧物酶。然后，由此固定化的捕獲蛋白被標(biāo)記物結(jié)合，所述標(biāo)記物例如為攜帶標(biāo)記的結(jié)合珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白二抗。01261或者，二抗可沒有標(biāo)記，但其又可被標(biāo)記的三抗結(jié)合，該三抗對該二抗所來源物種的抗體是特異性的。二抗可以用可檢測部分如生物素修飾，該可檢測部分可纟皮第三種標(biāo)記的分子如酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白特異性結(jié)合。2)競爭性測定形式10127在竟?fàn)幮詼y定中，在樣品中存在的分析物(血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等)的量通過檢測加入的(夕卜來的)分析物(例如結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、血紅蛋白、髓過氧物酶等)被樣品中存在的分析物由捕獲物(例如抗血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶抗體)中取代(或竟?fàn)幭氯?的量而間接檢測。在一個竟?fàn)幮詼y定中，將已知量的本案中的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等加入樣品，然后使樣品與捕獲物接觸，在本案中捕獲物為特異性結(jié)合血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的抗體。結(jié)合抗體的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的量與樣品中存在的分析物的濃度成反比。|0128]在某些實(shí)施方案中，抗體被固定在固體基質(zhì)上。結(jié)合抗體的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的量可如下測定檢測在抗體/分析物復(fù)合物中存在的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的量，或者檢測剩余的未復(fù)合的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的量。血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等的量可通過提供標(biāo)記的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、髓過氧物酶等來檢測。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法記錄本發(fā)明的測定。在測定蛋白的水平差異可檢測的情況下，本發(fā)明的測定通常被記錄為陽性。在某些實(shí)施方案中，改變?yōu)榻y(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改變，例如使用適于所提供的數(shù)據(jù)集的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(例如t-檢驗(yàn)、方差分析(ANOVA)、半?yún)?shù)技術(shù)、非參數(shù)技術(shù)(例如WilcoxonMann-Whitney檢驗(yàn)、Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)、Sign檢驗(yàn)、Kmskal-Wallis檢驗(yàn)等)來確定。統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改變優(yōu)選至少于85%的置信水平、更優(yōu)選至少于90%的置信水平、再更優(yōu)選至少于95%的置信水平、最優(yōu)選至少于98%或99%的置信水平為顯著的。在某些實(shí)施方案中，改變?yōu)橹辽?0%的改變，優(yōu)選為至少20%的改變，更優(yōu)選為至少50%的改變，最優(yōu)選為至少90%的改變。V.—氧化氮測定01361本發(fā)明的又一個發(fā)現(xiàn)是，促炎HDL消耗一氧化氮(產(chǎn)生硝酸鹽)，而保護(hù)性HDL基本上不消耗一氧化氮。因此，一氧化氮消耗/損耗的檢測提供了快速且方便的保護(hù)性HDL測定。01371檢測一氧化氮消耗的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些方法通常包括提供一氧化氮或一氧化氮的化學(xué)供體，并使用吸收光譜法或電化學(xué)方法來檢測一氧化氮的消耗。VI.LDL聚集測定本發(fā)明的測定可針對在特定背景中的用途而優(yōu)化，例如取決于生物樣品的來源和/或性質(zhì)和/或具體的測試物和/或可用的分析設(shè)備。因此，例如，優(yōu)化可以包括確定最佳的結(jié)合測定條件、最佳的樣品處理?xiàng)l件(例如優(yōu)選的分離條件)、最大化信噪比的抗體條件、改善通量的方法等。另外，可按照設(shè)備和/或試劑的利用度選擇和/或優(yōu)化測定形式。測形式的常規(guī)選擇和優(yōu)化是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員眾所周知的。VIII.試劑盒試劑盒可任選地包含用于收集血液和/或分離HDL和/或LDL等的額外材料。提供以下實(shí)施例是為了清楚說明本發(fā)明，而不是為了限制要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例1血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白的檢測2.取出上清液(血清或血漿)。注意如果樣品已被冷凍，則融化樣品，并在離心機(jī)中于室溫以12,000rpm離心5分鐘。這應(yīng)使血清或血漿中存在的可能影響測定的任何顆粒沉降。101503.向透明的圓底96孔板加入上清液(最多250)LiL/孔)。0151]4.向每個樣品加入1/5總體積的f茲珠試劑上清液(最多50laL/孔)并混合。使其靜置5分鐘。5.將板在^f茲性顆粒濃縮器頂部^:置5分鐘。2.制備洗滌緩沖液0.75mL吐溫20+150mL10XPBS+1350mLddH20。1.將樣品(血清或HDL上清液)以1:200稀釋到包被緩沖液中(2.5pLHDL稀釋到497.5|iiL包被緩沖液中)。4.向各孔加入50iliL的1:20000稀釋液。5.用300|uL洗滌緩沖液洗滌3次。反轉(zhuǎn)板并傾出內(nèi)容物，將其在吸水紙巾上觸碰4-5次，以在每步完全除去液體。加入TMB和終止溶液1.混合1份TMBA和1份TMBB。2.取出上清液(血清或血漿)。注意如果樣品已^皮冷凍，則融化樣品，并在離心機(jī)中于室溫以12,000rpm離心5分鐘。這應(yīng)使血清或血漿中存在的可能影響測定的任何顆粒沉降。0181]3.向透明的圓底96孔板加入上清液(最多250iliL/孔)。018214.向每個樣品加入1/5總體積的》茲珠試劑上清液(最多50iliL/孔)并混合。使其靜置5分鐘。7.于5°C以12,000rpm離心5分鐘，以除去任何J朱子。1.以1:4000將血漿/血清或HDL上清液稀釋入EIA稀釋液(在試劑盒中提供)中。01902.以1:100稀釋開始(5HDL稀釋入495nL稀釋液中)。3.制備1:100的40倍稀釋液(12.5|liL的1:100稀釋入487.5pL稀釋液中)。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線1.用4mLEIA稀釋液稀釋生物素化結(jié)合珠蛋白(在試劑盒中提供)。.■2.以一式三份向圓底96孔聚丙烯板加入35的每種標(biāo)準(zhǔn)品和每種樣品。3.使用多通道移液管由每個孔取出25|iL，加入人結(jié)合珠蛋白微板(在試劑盒中提供)。6.用200|uL洗滌緩沖液洗滌5次。反轉(zhuǎn)板并傾出內(nèi)容物，將其在吸水紙巾上觸碰4-5次，以在每步完全除去液體。加入鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物0201]1.短暫離心鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物。3.制備封閉/稀釋緩沖液20mL10XPBS+10mL吐溫20+0.5gBSA+170mLddH20。1.將樣品(血清或HDL上清液)以1:200稀釋到包被緩沖液中(2.5JULHDL稀釋到497.5包被緩沖液中)。4.將抗原輕敲入生物危害廢物容器中。3.以1:10000稀釋綴合HRP的山羊抗人血紅蛋白(ljaL抗體在10mL稀釋緩沖液)。3.向各孔加入100pL終止溶液。用讀板器讀數(shù)8.取出上清液。緩沖液的制備2.制備洗滌緩沖液0.75mL吐溫20+150mL10XPBS+1350mLddH20。0281j3.制備封閉/稀釋緩沖液20mL10XPBS+10mL吐溫20+0.5gBSA+170mLddH20。4.制備終止溶液1.38mLH2SQ4+48.62mLH20。制備HDL上清液1.以1:4000將HDL上清液稀釋入包被緩沖液中。0284]2.以1:100稀釋開始(5HDL稀釋入495pL緩沖液中)。02853.制備1:100(12.5iuL的l:100稀釋入487.5jaL緩沖液中)的40倍稀釋液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1.用2mL纟爰沖液重配100結(jié)合J朱蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(在試劑盒中提供)，以產(chǎn)生50jig/mL的濃度。028712.使標(biāo)準(zhǔn)品靜置10分鐘，在進(jìn)行稀釋前溫和攪拌。102883.通過用纟爰沖液以1:4連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液(50)Lig/mL)，得到12.5、3.13、0.78、0.195和0.049jug/mL溶液，制備一式三份的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。向;^入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品1.以一式三^f分向圓底96孔聚丙烯板加入110pL的每種標(biāo)準(zhǔn)品和每種樣品。4.將抗原輕敲入生物危害廢物容器中。1.制備包被緩沖液25mLddH20+8mL緩沖液A+17mL緩沖液B(緩沖液A:0.2MNa2CO3;緩沖液B:0.2MNaHCO3)。1.將樣品(HDL上清液)以1:200稀釋到包纟皮緩沖液中(2.5|iLHDL稀釋到497.5包被緩沖液中)。2.制備為1000ng/mL濃度的血紅素結(jié)合蛋白的包被緩沖溶液(2|liL血紅素結(jié)合蛋白的2mL包被緩沖溶液)。1.向所有孔加入200)iL封閉緩沖液，并于室溫溫育1小時。032612.用300jxL洗滌緩沖液洗滌3次。反轉(zhuǎn)板并傾出內(nèi)容物，將其在吸水紙巾上觸碰4-5次，以在每步完全除去液體。在這些實(shí)驗(yàn)中使用8-12周齡的C57BL/6J、LDLR無效/C57BL/6J和apoE無效/C57BL/6J雌性小鼠。小鼠在實(shí)驗(yàn)周期當(dāng)中攝取所述3種膳食中的一種普通飼料(RalstonPurina小鼠飼料)，或含有15.8%脂肪、1.25%膽固醇和0.5%膽酸(重量/重量/重量)的致動脈粥樣硬化膳食(Teklad/HarlanCatalog)或西餐(Teklad/Harlan,MadisonWI,膳食編號88137;42%脂肪、0.15%膽固醇，重量/重量)。血清樣品分離自過夜禁食小鼠，如前所述冷凍保存在10。/。蔗糖中(Navab等，(2000)丄丄^dAM.，41:1481-1494),并于-80。C儲存直至使用。脂蛋白分離如前所述測定HDL中的PON活性(VanLenten等，(1995)丄C""./謂就,96:2758-2767)。將HDL與對氧磷溫育，通過檢測12分鐘時間l殳內(nèi)于405nm的吸光度的增加分析PON活性。PON活性單位定義為施加的每mlHDL每分鐘形成1nmol4-硝基苯酚。膽固醇外流0344如前所述進(jìn)行細(xì)胞膽固醇外流(Navab等，(2004)Ocw/加o"，109:3215-3220)。簡而言之，在24孔組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)小鼠RAW264.7細(xì)胞，并在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中過夜生長。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，并與3H-膽固醇(0.5^Ci/ml)和乙酰化LDL(50pg/ml)—起加載至含0.5%無脂肪酸的BSA的培養(yǎng)基(Sigma,St.Louis,MO)中過夜。洗滌標(biāo)記的細(xì)胞，重懸浮在含0.5%BSA的培養(yǎng)基中，與HDL于37。C溫育6小時。膽固醇外流以釋放到培養(yǎng)基中的總放射性計(jì)數(shù)的百分率表示。用于SELDI分析的樣品制備10345按照生產(chǎn)商的方案(CiphergenBiosystems,Fremont,CA)在強(qiáng)陰離子交換(Q10)芯片上處理血清和HDL樣品。簡而言之，在濕潤室中于室溫用結(jié)合緩沖液(lxPBS/0.1。/。TritonX-100,pH7)平衡Q10陣列斑點(diǎn)15分鐘。每個樣品首先用9M尿素/2。/。Chaps/50mMTris.HCl,pH9.0以1:5稀釋，再用結(jié)合緩沖液稀釋至1:25。將5|il的每種稀釋樣品點(diǎn)樣到平衡過的Q10蛋白陣列芯片上，并在濕潤室中于室溫溫育30分鐘。用結(jié)合緩沖液洗滌芯片2次，用HPLCH20洗滌1次，然后風(fēng)干。先用0.5pi的100%飽和芥子酸溶液繼之以1pi的50%飽和芥子酸溶液序貫處理芯片。芥子酸溶液通過用芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)飽和EAM溶液(50%。腈和0.5%三氟乙酸)新鮮制備。Ciphergen蛋白芯片SELDI-TOF-MS分析用ProteinChip數(shù)據(jù)分析專欠件3.2版(CiphergenBiosystems)分析數(shù)據(jù)。對于每個比較，原始強(qiáng)度數(shù)據(jù)都使用各組別中所有分析譜的總離子電流標(biāo)準(zhǔn)化。對于低分子量范圍，峰值強(qiáng)度對3,000-25,000Da之間的w/z總離子電流標(biāo)準(zhǔn)化，對于高分子量范圍，峰值強(qiáng)度對4,000-250,000Da之間的w/z總離子電流標(biāo)準(zhǔn)化。生物標(biāo)記向?qū)?yīng)用(非參數(shù)計(jì)算；CiphergenBiosystems)用于編譯所有的光語和自動檢測定量的質(zhì)量峰。對各分析鐠組別進(jìn)行樣品統(tǒng)計(jì)(抗炎HDL對促炎HDL;正常血清對致動脈粥樣硬化血清)。計(jì)算各組之間的蛋白差異(倍數(shù)變化)。如果在與一組相比時觀察到其強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p〈0.05)，則"i人為蛋白在兩組之間是差異結(jié)合的。結(jié)杲模型系統(tǒng)令人感興趣的是，在與得自攝食西餐的小鼠的蛋白譜相比時(表8)，在攝食致動脈粥樣硬化膳食(或短期或長期)的C57BL/6J小鼠的HDL中未出現(xiàn)以下3種蛋白m/z5100、m/z35300和m/z197000。因?yàn)槟懰猁}為所用兩種膳食之間的主要差異，所以這3種蛋白有可能代表了膽酸鹽代謝和毒性特有的蛋白。這些蛋白的鑒定和表征可證實(shí)對理解與膽酸代謝相關(guān)的HDL炎癥特性有用。令人驚奇的是，當(dāng)由得自兩種其它的動脈粥樣硬化動物模型(攝食西餐的LDLR無效小鼠和攝食普通祠料的apoE無效小鼠)的促炎HDL制備蛋白譜并與C57BL/6J小鼠的促炎HDL的共有蛋白譜對比時，21個峰中只有14個是這3種模型所共有的(表8和表9)。表13.與C57BL/6J小鼠的致動脈粥樣硬化的/高脂血血清差異結(jié)合的SELDI峰。圓括號中的數(shù)字代表變化倍數(shù)下降的蛋白峰。NC-無變化，C-攝食普通飼料7天，A-攝食致動脈粥樣硬化膳食7天，AC-攝食致動脈粥樣硬化膳食7天，接著又?jǐn)z食普通飼料14天，CC=攝食普通飼料21天。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>8.8(1.9)NC9.0(2.0)(1.7)9.3(2.5)(1.8)9.5(2.3)NC9.94.3NC10.92.42.711.6(1.9)(1.8)12.0(3.0)1.312.3(1.7)NC12.8(4.0)(1.7)13.22.21.513.51.9NC14.01.5(1.4)14.4(4.9)NC14.78.8NC14.913.2NC15.19.4NC15.318.04.615,616.6NC15.814.4NC16.27.7NC16.55.8NC16.93.3NC17.22.3NC45.70.7)NC47.4(1.5)NC49.6(2.6)NC50.9(2.4)NC51.7(1.9)NC53.3(3.7)NC60.41.4NC72.3(3.8)NC75.0(4.0)NC81.111.3NC82.42.3NC84.5(2.7)NC85.92.4NC88.1(1.3)NC90.0(1.40NC102.8(1.6)NC107.32.3NC115.691,4)NC153.9(1.4)NC164.52.5NC181.2(1.6)NC210.97.9NC245.1(1.8)NC總之，我們已在促炎HDL中表征了8個m/zSELDI生物標(biāo)記峰，并證實(shí)它們在致動脈粥樣硬化/高脂血血清中差異表達(dá)?？傊?，這些標(biāo)記將有助于確定在小鼠中參與正常/抗炎HDL轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺譎DL的分子機(jī)制。這些標(biāo)記以及在人促炎HDL中的標(biāo)記的鑒定有利于開發(fā)臨床測定來改善動脈粥樣硬化和以炎癥反應(yīng)為特征的其它病況的早期檢測。實(shí)施例3與攝食致動脈粥樣硬化/高脂血膳食的小鼠血清中的高密度脂蛋白結(jié)合的血紅蛋白為確定代表兩個SELDI峰的蛋白的身份，我們首先檢驗(yàn)兩個峰的pl范圍。如在方法下所述，對得自攝食普通銅料或致動脈粥樣硬化膳食達(dá)7天(短期)或15周(長期)的C57BL/6J小鼠(每組n=8)的單個血清樣品進(jìn)行陰離子交換分級分離。級分用不同pH的緩沖液洗脫，并用CM10和Q10SELDI芯片進(jìn)一步分析(圖21)。代表兩個峰m/z14.9k和m/z15.6k的大部分強(qiáng)度被在pH7.5至pH8.0范圍內(nèi)的li沖液洗脫下來(圖21)。使用由SELDI-TOF-MS分析確定的大小和由陰離子交換分級分離確定的對應(yīng)pl進(jìn)行在線Tagldent(蛋白數(shù)據(jù)庫)檢索(圖21)。使用容許0.5%大小偏差和+2pl范圍的檢索標(biāo)準(zhǔn)，將Hb-a和Hb-(3分別鑒定為14.9kDa和15.6kDa的潛在候選蛋白?；谖墨I(xiàn)，游離Hb的pI在7.5-8.5的范圍內(nèi)。令人感興趣的是，還發(fā)現(xiàn)代表m/z14.9k和m/z15.6k的兩個峰與來自致動脈粥樣硬化血清的、用pH7.0和pH4.0緩沖液洗脫的級分結(jié)合(圖21)。這些數(shù)據(jù)提示，i)在致動脈粥樣硬化的樣品中的Hb具有不同的化學(xué)特性，或ii)代表m/z14.9k和m/zl5.6k的蛋白與Hb不同。如下所示，隨后的研究揭示，這些峰實(shí)際上的確代表Hb，與HDL結(jié)合的Hb的不同的物理和化學(xué)特性起因于與其它結(jié)合HDL的蛋白如結(jié)合珠蛋白的緊密結(jié)合。分級分離和胰蛋白酶肽片段化以及通過串聯(lián)質(zhì)語分析證實(shí)兩個生物標(biāo)記蛋白的身份為Hb-a和Hb-B%oxyHb[me卿%metHb總,7D國C0.79882%0.176418%0.97447D-A12.4287%1.81813%14.238W15A14.5892%1.2488%15.828討論Hb是與血糖過多、氧化應(yīng)激、高血壓、胰島素4氐抗、肥胖和4尿病相關(guān)的損傷和疾病的已知標(biāo)記(Zhang等，(2004)尸n^e麵/cs4:244-256;deValk和Marx(1999)」n:/2Mm她d.159:1542-1548;Alayash等，(2001)爿""'o;cW尺^to;cSz'gm/3:313-327)。Hb也被認(rèn)為是有毒的，因?yàn)橛坞xHb因其血紅素(Fe)和結(jié)合血紅素的反應(yīng)基而也是潛在的氧化劑(Alayash(1999)說oto:/"o/.17:545-549)，還已經(jīng)表明所述結(jié)合血紅素的反應(yīng)基在體內(nèi)氧化LDL(Paganga等，(1992)303:154-158;Miller等，(1996)爿"/25/oc/zem5Zo//2;^.326:252-260;Ziouzenkova等,(1999)/.S/o/.CTzew..274:18916-18924)。我們的發(fā)現(xiàn)首次表明，在氣化應(yīng)激環(huán)境中，在小鼠中Hb與HDL級分結(jié)合。在致動脈粥樣硬化血清中的促炎HDL含有脂質(zhì)氫過氧化物(LOOH),沒有對氧磷酶活性，活化單核細(xì)胞，不能防止LDL氧化和表現(xiàn)出4支少的膽固醇外流。在此我們才艮告，在致動脈粥樣硬化小鼠中Hb與促炎HDL特異性結(jié)合。不囿于具體理i侖，我們認(rèn)為，Hb與HDL結(jié)合涉及HDL由抗炎向促炎的轉(zhuǎn)變。表16.用于LDL聚集測定的材料材料供應(yīng)商/來源目錄號1Qproteome不含白蛋白/IgG的柱子Qiagen375212LDL超離心N/A350mMTris,150mMNaCl,2mMN/ACaCl2緩沖液496孔板Costar3596來自蠟樣芽胞桿菌(6acz7/wSigmaP6621cwe^)的磷脂酶C(PLC)方法樣品的制備1.用75fiL稀釋緩沖液稀釋25)iiL血清或血漿。0400]2.以500xg短暫離心不含白蛋白/IgG的離心柱，以便由螺旋帽取出樹脂。11.用2x100jxL等份的稀釋緩沖液洗滌柱，通過以500xg離心10秒收集每4分洗滌級分。12.合并步驟10的流出級分和步驟11的兩個洗滌級分。去除含有ApoB的蛋白和膽固醇測定10411]1.通過硫酸葡聚糖沉淀將含有ApoB的蛋白由不含白蛋白的樣品中去除。對于用硫酸葡聚糖沉淀，將含有硫酸葡聚糖和鎂離子的SigmaHDL膽固醇試劑溶解在蒸餾水中。將50pl的石危酸葡聚糖(1.0mg/ml)與500的每種樣品混合，并于室溫溫育5分鐘，隨后以3,000g離心IO分鐘。在實(shí)驗(yàn)中使用含有HDL的上清液。1.向PLC小瓶(250單位/瓶)加入足量的.ddH20,以得到56.3單位/mL。例如，向含有250單位的小瓶加入4.4mLddH20。2.在nutator上于37。C溫育板1小時。[0420J3.用讀板器以478nm的波長讀板。與PLC溫育[0421溶液。[0422[0423[0424[04251.除"單獨(dú)的LDL"之外的每個孔均接受20pLPLC2.向200i^LPLC溶液加入200緩沖液。3.短暫渦旋。4.如所示向各孔加入20^L的稀釋的PLC溶液。5.于478證在0分鐘、5分鐘、IO分鐘、30分鐘、45分鐘和60分鐘時讀板。實(shí)施例5D-4F治療降低小鼠中血紅蛋白及其清除劑與高密度脂蛋白的結(jié)合目標(biāo)0426我們先前已報(bào)告，載脂蛋白A-I(apoA-I)模擬物D-4F在小鼠和猴子中將HDL由促炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡?。由于已發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化動物模型中血紅蛋白(Hb)與HDL結(jié)合，并在致動脈粥樣硬化條件下有助于HDL的促炎性質(zhì)，我們設(shè)法確定D-4F治療在動脈粥樣硬化動91物模型中是否可降低Hb與促炎HDL的結(jié)合。方法和結(jié)果[0427圖2中的數(shù)據(jù)表明，取自apoE無效小鼠(動脈粥樣硬化小鼠模型)的HDL是促炎的。在給予口服apoA-I模擬肽(D-4F)之后，HDL被轉(zhuǎn)變成抗炎的。如在圖3和4中所示，與HDL的炎癥特性改變相一致，在小鼠血清中的血紅素結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白的濃度下降。[0428分析小鼠的HDL表明，在將促炎HDL平行轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡椎耐瑫r，小鼠HDL中的結(jié)合珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白的含量也下降，而HDL中的apoA-I含量沒有改變(圖5)。在血清和HDL的血紅素結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白的水平降低的同時，以類似于正常RBC血紅蛋白的特性遷移的非RBC血紅蛋白的濃度增加(圖6),HDL的血紅蛋白含量下降(圖7最右側(cè)的條圖)。如在圖29和30中所示，給予D-4F還顯著降低HDL-上清液中的轉(zhuǎn)鐵蛋白和髓過氧化物酶的含量。結(jié)論[04291Hb及其清除物蛋白血紅素結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白是促炎HDL的組分。D-4F將促炎HDL轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡譎DL的其中一種機(jī)制可為通過防止和/或逆轉(zhuǎn)含有促氧化物Hb的蛋白與HDL的結(jié)合。用將促炎HDL轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡譎DL的物質(zhì)治療明顯伴隨著結(jié)合HDL的血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和髓過氧物酶的改變。這些結(jié)果表明，本文所述測定可用于監(jiān)測改善異常功能HDL和降低動脈粥樣硬化的療法。[0430要理解的是，本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于闡述目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會想到依據(jù)本發(fā)明的多種修改或變化，其包括在本申請的精神和范圍以及隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文援引的所有出版物、專利和專利申請?jiān)谒星闆r下都在此引入作為參考。權(quán)利要求1.一種在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括由所述哺乳動物提供生物樣品，所述樣品包含HDL；和檢測兩種或更多種與HDL結(jié)合的蛋白，其中所述兩種或更多種蛋白選自m/z比率約9.3的蛋白、m/z比率約14.9的蛋白、m/z比率約15.6的蛋白、m/z比率約15.8的蛋白、m/z比率約16.2的蛋白、m/z比率約16.5的蛋白、m/z比率約18.6的蛋白和m/z比率約19.5的蛋白，其中檢測到所述兩種或更多種與HDL結(jié)合的蛋白表明所述HDL為促炎HDL。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測包括檢測3種以上的所述蛋白。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測包括檢測4種以上的所述蛋白。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測包括檢測5種以上的所述蛋白。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測包括檢測6種以上的所述蛋白。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測包括檢測7種以上的所述蛋白。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測包括檢測全部8種所述蛋白。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物為人。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物為診斷為患有動脈粥樣硬化的人。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述哺乳動物為診斷為面臨動脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的人。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測包括免疫測定。12.—種在哺乳動物中^r測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括檢測含血紅素和/或結(jié)合血紅素的、與所述哺乳動物的HDL結(jié)合的蛋白的水平，其中含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白水平與正?？寡譎DL中存在的含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白水平相比提高表示所述HDL為促炎HDL。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白包括一種或多種選自以下的蛋白血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、可溶性CD163和髓過氧物酶。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括檢測與HDL結(jié)合的血紅蛋白的量和檢測與HDL結(jié)合的結(jié)合珠蛋白的量。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法包括計(jì)算與HDL結(jié)合的血紅蛋白和結(jié)合珠蛋白的乘積。16.權(quán)利要求12的方法，所述方法還包括檢測血漿的非脂蛋白級分中的相同的所述含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水平，其中在HDL中的含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿的非脂蛋白級分中的含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率與具有正常抗炎HDL的目標(biāo)對象中存在的該比率相比增加表示所述哺乳動物的HDL為促炎HDL。17.權(quán)利要求12的方法，其中所述檢測包括免疫測定。18.權(quán)利要求12的方法，其中所述檢測包括ELISA。19.一種在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括檢測與所述哺乳動物的HDL結(jié)合的一種或多種含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水平；檢測所述哺乳動物的血漿中的一種或多種所述相同的含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的水平，其中HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于1表示所述哺乳動物的HDL為促炎HDL。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白包括選自以下的一種或多種蛋白血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、可溶性CD163和髓過氧物酶。21.權(quán)利要求19的方法，其中對于所述蛋白中的兩種或更多種而言，HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于1表示所述哺乳動物的HDL為促炎HDL。22.權(quán)利要求19的方法，其中對于所述蛋白中的三種或更多種而言，HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于1表示所述哺乳動物的HDL為促炎HDL。23.權(quán)利要求19的方法，其中對于所述蛋白中的1、2、3或4種而言，HDL含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白對血漿含血紅素和/或結(jié)合血紅素的蛋白的比率大于選自1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3和0.2的值，表示所述哺乳動物的HDL為促炎HDL。24.—種在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括測定與所述哺乳動物的HDL結(jié)合的血紅素水平，其中與HDL結(jié)合的血紅素水平相比于與保護(hù)性HDL結(jié)合的血紅素水平升高表示所述HDL為促炎HDL。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述升高的水平在等于或大于90%、95%、98%或99%的置信水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異性意義。26.—種在哺乳動物中纟全測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括測定所述哺乳動物的HDL的鐵含量，其中所述HDL的鐵含量水平相比于正常抗炎HDL的4失含量升高表示所述哺乳動物的所述HDL為促炎HDL。27.權(quán)利要求26的方法，其中升高的水平在等于或大于90%、95%、98%或99%的置信水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異性意義。28.—種在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括測定與所述哺乳動物的HDL結(jié)合的含鐵蛋白的水平，其中與所述HDL結(jié)合的含鐵蛋白的水平相比于與正常抗炎HDL結(jié)合的含鐵蛋白的水平升高表示所述哺乳動物的所述HDL為促炎HDL。29.權(quán)利要求28的方法，其中升高的水平在等于或大于90%、95%、98%或99%的置信水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異性意義。30.—種檢測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括測定HDL消^^一氧化氮的能力，其中HDL消耗一氧化氮的能力相比于正常抗炎HLD消耗一氧化氮的能力增加表示促炎HDL的存在情況、量或活性。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述一氧化氮以化學(xué)方式產(chǎn)生。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述一氧化氮通過電子信號檢測。33.一種在哺乳動物中測定以炎癥反應(yīng)為特征的病癥的存在情況或易患病體質(zhì)的方法，所述方法包括實(shí)施權(quán)利要求1-32中的任一種或多種測定，其中陽性測試結(jié)果指示存在所述病癥或?yàn)槠湟谆疾◇w質(zhì)。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述病癥選自動脈粥樣硬化、中風(fēng)、麻風(fēng)、肺結(jié)核、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性多肌痛、結(jié)節(jié)性多動脈炎、硬皮病、特發(fā)性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、哮喘、阿爾茨海默氏病、慢性腎衰竭、糖尿病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性腎病、移植排斥、移植動脈粥樣硬化、缺血再灌注、成人呼吸系統(tǒng)綜合征、充血性心力衰竭、腎小球炎、代謝綜合征、多發(fā)性硬化、膿毒病綜合征、鐮狀細(xì)胞病、血管性癡呆、克羅恩氏病、內(nèi)皮功能障礙、小動脈功能障礙、AIDS、風(fēng)濕性多肌痛、結(jié)節(jié)性多動脈炎、硬皮病、特發(fā)性肺纖維化、冠狀動脈鈣化、鈣化性主動脈瓣膜狹窄、骨質(zhì)疏;^、細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、自身免疫病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。35.—種治療患有以炎癥反應(yīng)為特征的病癥的人的方法，所述方法包括實(shí)施權(quán)利要求1-32中的任一種或多種測定；并為在所述測定中測試陽性的那些對象處方更積極的療法。36.—種在哺乳動物中檢測或定量促炎HDL的方法，所述方法包括使所述哺乳動物的HDL與LDL接觸，并檢測所述LDL的聚集，其中LDL聚集水平與和正?？寡譎DL接觸的LDL的聚集相比升高表示所述哺乳動物的所述HDL為促炎HDL。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述聚集通過分光光度法檢測LDL聚集速率來測定。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述聚集使用不含白蛋白的柱子測定。全文摘要本發(fā)明提供檢測異常功能HDL的新測定。該測定是用于動脈粥樣硬化或以炎癥反應(yīng)為特征的其它病癥的良好診斷和/或預(yù)測預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，該方法包括檢測血紅素相關(guān)性HDL結(jié)合蛋白(例如結(jié)合珠蛋白、血紅素結(jié)合蛋白等)，和/或檢測血漿/血清的HDL和非脂蛋白級分之間的HDL結(jié)合蛋白的相對分布，和/或檢測促炎HDL消耗一氧化氮的能力，和/或檢測HDL抑制LDL聚集的能力。文檔編號G01N33/53GK101467041SQ200780011796公開日2009年6月24日申請日期2007年2月9日優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日發(fā)明者A·M·富格爾曼,S·T·雷迪申請人:加州大學(xué)評議會