一種支持cho高密度懸浮培養(yǎng)的無血清無蛋白培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種支持CHO高密度懸浮培養(yǎng)的無血清無蛋白培養(yǎng)基。公開了培養(yǎng)基組分包括氨基酸、微量元素及無機鹽、維生素、碳水化合物和其他有機分子，其中含有類固醇激素，而不含有轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基化學成分明確，無動物來源，污染風險小，能適用于多種不同CHO細胞株生長，細胞培養(yǎng)效果好，有利于下游分離和純化。
【專利說明】—種支持CHO高密度懸浮培養(yǎng)的無血清無蛋白培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于CHO細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002]細胞培養(yǎng)技術(shù)是通過模擬細胞體內(nèi)生長環(huán)境實現(xiàn)細胞體外培養(yǎng)。培養(yǎng)基為細胞體外培養(yǎng)提供營養(yǎng)并促進細胞生長和增殖。細胞培養(yǎng)基的發(fā)展經(jīng)歷了雞胚汁、天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基，以及目前常用的低血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和化學成分清晰的培養(yǎng)基。
[0003]通常，動物細胞的生長均有賴于血清的存在.在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分細胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源，價格昂貴，批間差異大，對生產(chǎn)和科研帶來諸多不便。科學家發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入替代血清作用的補充因子，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等成分，不少細胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長。無血清培養(yǎng)基規(guī)避了血清帶來的風險。便于產(chǎn)品的分離純化。然而，一般一種無血清培養(yǎng)基只適用于一類細胞的培養(yǎng)，而且容易受到理化因素的影響。另外無血清培養(yǎng)基通常含有替代血清的蛋白和脂類，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂類添加劑和胰島素等，仍然存在一定的污染風險和分離純化的障礙，成本也比較高。
[0004]中國倉鼠卵巢細胞-CHO細胞(Chinese hamster ovary cell)目前被廣泛用于生產(chǎn)各種基因工程蛋白產(chǎn)品。適合用于CHO細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，根據(jù)它的來源及成分的明確程度來劃分，其發(fā)展大致可分為三個階段:即天然培養(yǎng)基階段(直接采用某些組織凝塊、生物性液體和組織提取液等作為細胞的培養(yǎng)基)，合成培養(yǎng)基階段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F(xiàn)12等)和無血清培養(yǎng)基階段。合成培養(yǎng)基通常需在其中添加一些諸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5 —15%)等天然的體液性補充物才能較長時間地維持細胞生長。血清的主要作用在于向細胞提供激素(生化因子)、轉(zhuǎn)移蛋白和其它營養(yǎng)物質(zhì)等。但即使采用低血清培養(yǎng)，還是不能忽視血清帶來的問題(如在培養(yǎng)過程中貼壁，不適用于大規(guī)模培養(yǎng))。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢很大程度上體現(xiàn)在避免了血清的缺點，此外它還具有血清培養(yǎng)難以比擬的優(yōu)點，如保存和應(yīng)用方便；使用該種培養(yǎng)基制備的產(chǎn)品易于純化，提高回收率；成分明確，有利于研究細胞的生理調(diào)節(jié)機制等。但是，無血清培養(yǎng)基通常含有替代血清的蛋白和脂類，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂類添加劑和胰島素等，仍然存在一定的污染風險和分離純化的障礙，成本也比較高。而且，一般一種無血清培養(yǎng)基只適用于一類細胞的培養(yǎng)，容易受到理化因素的影響。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是一種無血清無蛋白培養(yǎng)基，能適用于多種不同CHO細胞株生長的全能型培養(yǎng)基，它化學成分明確，無動物來源，其使用不僅將污染的風險降到最小，更有利于下游的分離和純化。
[0006]本發(fā)明是在商業(yè)化出售的培養(yǎng)基DMEM/F12 (可從Sigma, GIBCO等公司購買)基礎(chǔ)上進行開發(fā)，能夠支持細胞生長和穩(wěn)定傳代的無血清無蛋白培養(yǎng)基，可適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
[0007]無血清無蛋白培養(yǎng)基的組分一般包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、微量元素、類固醇激素和相關(guān)蛋白替代物，如何對這些成分進行合理設(shè)計，是開發(fā)和優(yōu)化無血清無蛋白培養(yǎng)基的關(guān)鍵。
[0008]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0009](I)選擇添加可替代生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素的組分如:孕酮、氫化可的松，檸檬酸鐵，硫酸鋅等物質(zhì)；
[0010](2)利用統(tǒng)計學實驗設(shè)計確定各個組分的最佳劑量；
[0011]基于以上考慮，本發(fā)明的培養(yǎng)基主要由以下幾方面的組分構(gòu)成:
[0012]氨基酸:培養(yǎng)基中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，用于蛋白、核酸以及脂類等物質(zhì)的合成，還可以通過幾個主要的中間代謝節(jié)點進入TCA循環(huán)，用于能量的生成，并同其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝相關(guān)聯(lián)。;
[0013]無機鹽:NaCl維持滲透壓平衡，協(xié)調(diào)共同轉(zhuǎn)運有機大分子進入細胞-X，Ca2+，Mg2+，Zn2+等離子則參予代謝與信號轉(zhuǎn)導以及促進貼壁和細胞增殖；各種陰離子(S042—，NO3—等)，則主要用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)細胞膜勢能或作為含硫或氮元素有機分子的前體；
[0014]維生素:培養(yǎng)基中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，維生素在培養(yǎng)基中存在的量很微量，但在細胞代謝中作為細胞功能有機催化劑，起重要的調(diào)控作用。
[0015]碳水化合物:葡萄糖是主要的碳水化合物，作為主要的碳源和能源物質(zhì)。
[0016]微量元素:微量元素主要起調(diào)節(jié)、傳遞和控制的作用，在無血清培養(yǎng)基中的作用尤為重要,如:
[0017]Fe:酶和血紅素的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。
[0018]Cu:超氧化物歧化酶的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。
[0019]Mg:對ATP酶、激酶等起活化作用。
[0020]Zn:酶的輔基。
[0021]Co:維生素B12的組成部分。
[0022]此外，培養(yǎng)基中還加入酚紅用作培養(yǎng)基pH的指示劑，為適合細胞發(fā)酵罐中的大規(guī)模培養(yǎng)而添加有0.1%的Pluronic F68以消除剪切力的影響。
[0023]根據(jù)將以上各類物質(zhì)對細胞生長的不同作用，本發(fā)明將以上類別的物質(zhì)按以下濃度進行設(shè)置:
[0024]氨基酸的組分和用量:
[0025]

【權(quán)利要求】
1.一種支持CHO高密度懸浮培養(yǎng)的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基組分包括，氨基酸、微量元素及無機鹽、維生素、碳水化合物和其他有機分子，其中含有類固醇激素，而不含有轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中氨基酸的組分和用量如下，
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中微量元素及無機鹽的組分和用量如下，
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中維生素的組分和用量如下，
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中碳水化合物和其他有機分子的組分和用量如下，
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中各組分和用量如下，

微量元素及無機鹽的組分和用量，

碳水化合物和其他有機分子的組分和用量，

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中各組分和用量如下，

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基干粉中還含有植物來源經(jīng)超濾后的水解物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，水解物的用量為4g/l。
10.權(quán)利要求1-9任一所述的培養(yǎng)基配置方法,其特征在于， a.將單位體積的培養(yǎng)基干粉加入90%單位體積的超純水中，設(shè)置溫度35°C左右，攪拌半小時，b.加入一定量的氫氧化鈉助溶，然后加入濃鹽酸和碳酸氫鈉，調(diào)節(jié)PH到.6.9-7.4，c.用0.2um負壓過濾，無菌避光保存。
【文檔編號】C12N5/071GK104073463SQ201310106385
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】胡輝, 李軍, 翁志兵 申請人:上海中信國健藥業(yè)股份有限公司