一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬離子的免疫學(xué)檢測(cè)，具體涉及一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及 其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，簡(jiǎn)稱HDL)、中間密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein，簡(jiǎn)稱IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，簡(jiǎn)稱LDL)、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,簡(jiǎn)稱VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron，CM)。血液中大約百分之三十的膽固醇是通過(guò)高密度脂蛋白從組 織細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)礁闻K轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過(guò)膽汁排出體外的。高密度脂蛋白由50%的蛋白、 30%的磷脂、25%的膽固醇（其中70%為膽固醇酯）、5%的三酰甘油組成。
[0003]高密度脂蛋白（簡(jiǎn)稱HDL)是血漿中主要脂蛋白之一，其密度最高，顆粒直徑最小， 蛋白和脂質(zhì)含量大致均等的異質(zhì)性脂蛋白。由50%的蛋白、30%的磷脂、25%的膽固醇（其 中70%為膽固醇酯）、5%的三酰甘油組成。
[0004]HDL是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要脂類(lèi)保護(hù)因素，其在血清蛋白中有很強(qiáng)的 抑制動(dòng)脈粥樣硬化作用，是冠狀動(dòng)脈疾病的重要保護(hù)因子，與冠心病危險(xiǎn)程度呈負(fù)相關(guān)。
[0005] 但是，研究表明高密度脂蛋白膽固醇的數(shù)量并不能與心血管疾病的保護(hù)程度成正 比，因?yàn)槠渲幸呀?jīng)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的高密度脂蛋白仍然可以測(cè)量到但已經(jīng)喪失正常功能甚至 會(huì)加重動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。而高密度脂蛋白膽固醇的數(shù)量下降則可顯著提示動(dòng)脈粥樣硬 化的保護(hù)性減弱，因而檢測(cè)定量血清中HDL對(duì)于冠心病具有重要意義，不僅可以用于早期 識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性，而且可以作為脂類(lèi)調(diào)節(jié)藥物治療過(guò)程的檢測(cè)以及預(yù)后評(píng)價(jià)的 指標(biāo)之一。
[0006] 絡(luò)（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過(guò)渡金屬，其質(zhì)地堅(jiān)硬，表面具有 光澤，有較高的熔點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，一個(gè)世紀(jì)以來(lái)被廣泛應(yīng)用，每年 全球鉻生產(chǎn)量高達(dá)107噸，因而鉻是一種名副其實(shí)的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應(yīng)用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個(gè)方面，與人們的生活息息相關(guān)，但是同樣也對(duì)人 類(lèi)的身體健康產(chǎn)生巨大影響。
[0007]自然界中鉻主要以三價(jià)和六價(jià)的形式存在，而一般認(rèn)為，三價(jià)鉻是人類(lèi)所需的微 量元素，而六價(jià)鉻才是明顯的毒性物質(zhì)。由于六價(jià)鉻易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而且可以通過(guò) 一系列反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性及基因毒性，因而普遍認(rèn)為六價(jià)鉻的毒性高于三價(jià)鉻，達(dá) 10 -100倍。學(xué)者認(rèn)為當(dāng)水中的六價(jià)鉻含量超過(guò)0.05mg/L即是有毒的。六價(jià)鉻可以通過(guò)皮 膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進(jìn)入人體，對(duì)于職業(yè)性暴露人群主要是 通過(guò)呼吸道吸入六價(jià)鉻灰塵，而對(duì)于普通人群則是通過(guò)飲入污染水源、食入被污染的食物、 吸入等方式攝入六價(jià)鉻。六價(jià)鉻進(jìn)入體內(nèi)后，可以引發(fā)氧化應(yīng)激、顯色體畸變、細(xì)胞凋亡、多 種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、Cr-DNA配合物形成等）， 從而造成機(jī)體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。
[0008] 如前所述，鉻與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白 酶的活性。隨著對(duì)鉻毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過(guò)程 中扮演著重要的角色，被認(rèn)為是了解鉻的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對(duì)鉻和蛋白質(zhì)相互作 用的研究就顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉻與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋 白質(zhì)與鉻之間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對(duì)于鉻與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。
[0009] 關(guān)于鉻中毒，特別是慢性鉻中毒的評(píng)價(jià)，通過(guò)檢測(cè)血鉻含量也不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)人體 內(nèi)的循環(huán)鉻含量，無(wú)法進(jìn)一步評(píng)估鉻對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā) 展，鉻與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可以從免疫功能角度評(píng)價(jià)鉻中毒，特別是慢 性鉻中毒對(duì)于機(jī)體的損害程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對(duì)鉻污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉻-高密度脂蛋白螯合物及 其制備方法，并建立鉻-高密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鉻-高 密度脂蛋白螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中 鉻-高密度脂蛋白螯合物，可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這 個(gè)地區(qū)鉻污染程度。
[0011] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鉻-高密度脂蛋白螯合 物，該鉻-高密度脂蛋白螯合物是鉻離子與高密度脂蛋白通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基螯 合而成。
[0012] 本發(fā)明還提供一種上述的鉻-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，即體外合成法， 包括以下步驟：
[0013] A)鉻-高密度脂蛋白的合成：在提純?cè)从谌梭w的高密度脂蛋白或按照生物學(xué)方法 重組的高密度脂蛋白中加入鉻離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0014] B)鉻-高密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液中 未反應(yīng)的高密度脂蛋白、特異性抗體和鉻離子，即得鉻-高密度脂蛋白螯合物。
[0015] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括以下步驟：
[0016] (1)溶解樣品：將上述步驟A)的鉻-高密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中，得 鉻-高密度脂蛋白螯合物溶液；
[0017] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與高密 度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0018] 所述能與高密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料為吸附有可與高密度脂蛋白特異性結(jié) 合物質(zhì)的硅膠或樹(shù)脂；
[0019] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)所述溶液，然后上柱，使高 密度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0020] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0021] (5)收集：收集步驟⑷的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0022] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0023] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0024] 所述能與鉻特異性結(jié)合的填料為吸附有可與鉻特異性結(jié)合物質(zhì)的硅膠或樹(shù)脂；
[0025] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0026] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0027] (10)收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0028] (11)透析：將步驟（10)的洗脫液裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透 析過(guò)夜，收集樣本，即得鉻-高密度脂蛋白螯合物。
[0029] 作為優(yōu)選，上述鉻-高密度脂蛋白螯合物的制備方法，還包括以下對(duì)鉻-高密度脂 蛋白螯合物的鑒定步驟，具體包括以下步驟：
[0030] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0031] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-高密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩沖 液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0032] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0033] (4)檢測(cè)：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS檢測(cè)是否含有鉻以及檢測(cè)鉻的含量。
[0034] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉻-高密度脂蛋白螯合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鉻-高密 度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-高密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試 劑盒。
[0036] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲高密度脂蛋白的蛋白或捕 獲金屬鉻的物質(zhì)。
[0037] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鉻-高密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的鉻-高密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、 酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鉻-高 密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉻-高密度脂蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié)合 法、提純鉻-高密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0038] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0039] 1.本發(fā)明首次合成了提取鉻-高密度脂蛋白螯合物；
[0040] 2.本發(fā)明首次提出鉻-高密度脂蛋白螯合物可用于制備檢測(cè)血樣中鉻-高密度脂 蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0041] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了螯合型高密度脂蛋白的特異性識(shí)別和定量檢測(cè)，以便定量檢測(cè)人 群血清中鉻-高密度脂蛋白螯合物的含量，以評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用，為工業(yè)地 區(qū)的鉻污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鉻-高密度脂蛋白螯合物定量檢測(cè)方法的準(zhǔn) 確度高、重復(fù)性好。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為本發(fā)明所述的鉻-高密度脂蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0043]圖2為本發(fā)明所述的鉻-高密度脂蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分 析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0045] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說(shuō)明，均視為可從市購(gòu)方式購(gòu)得：
[0046] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0047] 捕獲高密度脂蛋白的蛋白為抗高密度脂蛋白抗體，可通過(guò)市售獲得，如艾博抗 (上海）貿(mào)易有限公司出售的"Abeamabl57595"的anti-HDL抗體，以下實(shí)施方式中，所述 與高密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗高密度脂蛋白抗體、抗HDL抗體均為捕獲高密度脂 蛋白的蛋白；
[0048] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 稀釋緩沖液為