專利名稱：人血高密度脂蛋白、其制造方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人血高密度脂蛋白產(chǎn)品、其制造方法及其在藥劑學(xué)上的應(yīng)用，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
AS是因動脈壁脂質(zhì)沉積，纖維及結(jié)締組織增生，而造成動脈管壁增厚變硬，彈性減退并形成糜粥樣病灶的常見多發(fā)性疾病。AS引起的動脈管腔閉塞，可使心、腦、腎等重要器官供血不足，從而嚴(yán)重威脅人類健康和生命。目前臨床上常用的治療AS藥物，一般有擴(kuò)張血管藥物、降血脂藥物、抗血小板藥物及溶栓藥物等。這些藥物雖然可通過解除血管運(yùn)動障礙及調(diào)節(jié)血脂等作用對抗AS，但均不能安全、有效的預(yù)防和消除AS斑塊。并且由于AS是一種慢性非炎癥性、退行性和增生性的病變，長期使用某些藥物治療，會引起膽石癥、肝功能損傷等副作用。
大量流行病學(xué)研究表明，血脂升高、肥胖、高血壓、糖尿病以及吸煙等是AS主要危險因素。但是，目前對AS的防治并無理想的方法和藥物?，F(xiàn)階段防治AS除飲食控制外，在藥物治療上一般多選用降低血脂、擴(kuò)張血管或針對易患因子的藥物。因此發(fā)現(xiàn)和制備能夠預(yù)防，特別是可以促使AS逆轉(zhuǎn)或發(fā)生消退的新藥就十分必要。
七十年代以來大量流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血漿高密度脂蛋白(HDL)水平與動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。Framingham調(diào)查表明，血漿高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C，可以代表血漿HDL含量的指標(biāo))高的家庭或地區(qū)冠心病(CHD)發(fā)生率明顯降低。Rifkind等在調(diào)查的人群中發(fā)現(xiàn)，血漿HDL-C含量每增加1mg/dL，CHD的危險性就減少2-3％。Helsinki Heart Study(赫爾辛基心臟研究)也證實(shí)，如用藥物升高血漿HDL-C水平，男性CHD發(fā)生率可以下降34％。動物實(shí)驗(yàn)還證明，血漿HDL水平較低的動物如家免、猴、豬等均易誘發(fā)AS，相反血漿HDL含量較高的動物如貂、北京鴨和樹鼩等則不易甚至不產(chǎn)生AS。另外，細(xì)胞培養(yǎng)證明，HDL可促進(jìn)細(xì)胞(包括動脈平滑肌細(xì)胞)內(nèi)膽固醇的移出，動物實(shí)驗(yàn)也證明HDL有抑制AS斑塊形成及促進(jìn)斑塊消退的作用。這些都說明HDL具有對抗AS的作用。而且由于HDL是來源于人血漿的天然藥物，在預(yù)防和治療AS的長期過程中具有其它人工合成藥物無法比擬的優(yōu)勢。
HDL主要由載脂蛋白和脂質(zhì)組成，是血漿中密度最高但組成極不均一的一類脂蛋白。HDL是由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的脂蛋白，它含蛋白質(zhì)50％～55％，主要由載脂蛋白(apo)AI和AII構(gòu)成，另含少量的apoAIV、CI、CII、CIII、D、E以及J，HDL含脂質(zhì)約45％～50％，主要由磷脂(PL，40～60％)、膽固醇及膽固醇酯(總膽固醇TC，30％～40％)及少量甘油三酯(TG，10％左右)構(gòu)成。在HDL中apoAI的含量最多而且又是HDL主要的功能蛋白質(zhì)，因此可以用apoAI的含量反映HDL的含量。
目前國內(nèi)外大多數(shù)血液制品均采用Cohn氏低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白和丙種球蛋白，該法在分離過程中可將血漿蛋白分成I、II、III、IV、V等五個組分，其中富含HDL的組分IV-1(FIV-1)目前均用作廢物處理，未予利用，實(shí)際上是一種巨大的浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一目的是提供人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品的制造方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品在制備治療多器官功能障礙綜合癥(MODS)、心血管系統(tǒng)疾病，如AS以及中和細(xì)菌毒素等急性癥狀藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的人血高密度脂蛋白中，apo AI含量為77-88％。
上述的人血高密度脂蛋白中apoAI分子量為27.7KD。
本發(fā)明所述的人血高密度脂蛋白產(chǎn)品中可含有0.1-99％的人血高密度脂蛋白。
上述的人血高密度脂蛋白產(chǎn)品可以加入9～11％蔗糖和/或0.5％白蛋白和/或150mg±1mg/L維生素C，制成供靜脈輸注的人血HDL制劑，該制劑有著良好的穩(wěn)定性。
上述的HDL不限于本發(fā)明所述的HDL，現(xiàn)有技術(shù)中的HDL同樣適用前述的組合互配。
本發(fā)明所述方法包括以下步驟A.取原料血漿，加入1/5～1/4體積的50％乙醇，調(diào)節(jié)pH值為6.8-7.4，在-4～-2℃下攪拌1-3小時，靜置6-8小時，離心，得上清；向上清滴加緩沖溶液至混合液pH為6.5-7.0，加入1/5～1/4混合液體積的95％乙醇，在-6～-4℃下攪拌1-3小時，靜置6-8小時，離心，得上清；向上清液中補(bǔ)加45-50％體積的注射用水，滴加緩沖溶液使pH為4.5-5.5，在-6～-3℃下攪拌1-3小時，靜置1-3小時，離心，棄上清，得沉淀；B.沉淀用2-3倍重量的0.02～0.1M NaCl溶液溶解，調(diào)pH至5.2±0.5后，在0～2℃下攪拌2-6小時，然后離心得沉淀；沉淀用50-150倍重量的0.1～0.2M NaCl溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為7.2±0.5，在2-8℃下攪拌6-20小時，過濾得濾液；C.上述濾液加入緩沖液，使pH為5.2±0.5，攪拌1-3小時，在2～4℃下，靜置6-20小時，離心收集沉淀；沉淀用50～150倍量的0.1～0.2M NaCl溶液溶解，調(diào)pH至7.2±0.5，攪拌使沉淀完全溶解，過濾，得濾液；D.濾液用超濾膜超濾，脫鹽并濃縮，得富含HDL的溶液，經(jīng)后處理，得HDL及其產(chǎn)品。
上述方法中調(diào)節(jié)pH使用1mol/L NaHCO3溶液。
上述方法中的緩沖液為pH＝4的HAC/NaAC緩沖體系。步驟C結(jié)束后可根據(jù)需要重復(fù)一遍，以使達(dá)到更好的純度。
步驟D中的超濾膜為8-70KD超濾膜。優(yōu)選使用30～50KD超濾膜，其具有進(jìn)一步純化的作用。
步驟D所述的后處理可以是超濾濃縮液加9～11％注射用蔗糖或0.5％白蛋白，按每升加入150mg±1mg注射用維生素C，調(diào)pH至7.2±0.5，得HDL溶液；上述HDL溶液于微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL溶液，除菌分裝，并于2～8℃保存。
采用本發(fā)明方法制備HDL，apoAI的回收率可達(dá)69％以上，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明方法以低溫乙醇法制備人血白蛋白及丙種球蛋白棄去的FIV-1沉淀為原料，在pH5.1±0.5、0～2℃以及0.03MNaCl的條件下，通過洗滌充分除去HDL以外的其它血漿蛋白。HDL粗品溶解后再于pH5.1±0.5(等電點(diǎn))、2～4℃、0.15M NaCl的條件下重沉淀精制。最后純化的HDL溶液經(jīng)超濾、透析、濃縮、配制、60±1℃，10小時滅活病毒及除菌制成pH 6.4～7.4、載脂蛋白AI含量≥0.5％、純度≥95％，含10％±1％蔗糖的人血HDL制品。
在HDL制備過程中，在分離各步驟調(diào)節(jié)適當(dāng)酒精濃度在6～30％、蛋白濃度在1～6％、pH值在4.5～7.5、離子強(qiáng)度在0.02～2.0kΩ·cm、溫度在-6～10℃。
HDL是由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的脂蛋白，它含蛋白質(zhì)50％～55％，主要由載脂蛋白(apo)AI(65％～70％)和AII(20％～25％)構(gòu)成，另含少量的apoAIV、CI、CII、CIII、D、E以及J。HDL含脂質(zhì)約45％～50％，主要由磷脂(PL，40～60％)、膽固醇及膽固醇酯(總膽固醇TC，30％～40％)及少量甘油三酯(TG，10％左右)構(gòu)成。在HDL中apoAI的含量最多而且又是HDL主要的功能蛋白質(zhì)。因此可以用apoAI的含量反映HDL的含量。發(fā)明人采用華西醫(yī)科大學(xué)載脂蛋白研究室研制的載脂蛋白AI檢測試劑盒(單向免疫擴(kuò)散法)，檢測apoAI含量并以制品中apoAI含量代表HDL含量，以apoAI含量≥0.5％為合格。
研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞、動脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的細(xì)胞膜上存在可特異結(jié)合HDL的受體。發(fā)明人采用預(yù)包被在酶標(biāo)板上的肝細(xì)胞膜HDL受體與HDL發(fā)生特異結(jié)合反應(yīng)，再與辣根過氧化物酶-抗體交聯(lián)物HRP-抗apoAI IgG發(fā)生免疫學(xué)結(jié)合反應(yīng)，最后通過吸附在酶標(biāo)板固相上的受體-配體(HDL)-抗配體抗體-酶復(fù)合物中酶催化的顯色反應(yīng)檢測制品中HDL的生物活性。生物活性測定時，以1μg apoAI作為1個HDL活性單位(U)。由于HDL制品apoAI含量≥0.5％，即相當(dāng)于含有5×105U HDL(理論值)，因此發(fā)明人以該值的80％作為判斷制品合格的標(biāo)準(zhǔn)，即HDL制品生物活性應(yīng)≥4×105U。
本發(fā)明HDL產(chǎn)品的動物急性毒性試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明HDL用靜脈注射及腹腔注射兩種途徑給藥，以提取中最高濃度(1％)作為最大給藥濃度，以靜脈注射及腹腔注射給藥最大體積0.8ml/20g(體重)給藥，12h內(nèi)連續(xù)給藥3次，給藥連續(xù)觀察7天，動物均未發(fā)現(xiàn)異常，7天后動物無一死亡，故HDL靜脈注射及腹腔注射給藥小鼠最大耐受量為0.024g/20g(體重)。
本發(fā)明HDL產(chǎn)品的穩(wěn)定性試驗(yàn)根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局1993年7月編制的“新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué))”對人血HDL制品進(jìn)行了影響因素試驗(yàn)、室溫(25℃)5個月留樣考察和2～8℃14個月留樣考察。結(jié)果顯示，HDL考察樣品能夠耐受流通領(lǐng)域和使用過程中條件變化的影響，制品的貯存條件應(yīng)嚴(yán)格控制在2～8℃和避光下保藏，這樣即可保證在1年內(nèi)，HDL液體制劑在流通和使用過程中保持《中國生物制品規(guī)程》要求的各項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定不變。
本發(fā)明HDL產(chǎn)品與治療作用有關(guān)的主要藥效學(xué)試驗(yàn)為了驗(yàn)證本發(fā)明人血漿HDL制品的抗AS作用，發(fā)明人以高脂飼養(yǎng)造成家兔As模型，在高脂飼養(yǎng)的同時(實(shí)驗(yàn)性As預(yù)防試驗(yàn))以及在高脂飼養(yǎng)10周造成AS模型后(實(shí)驗(yàn)性AS治療試驗(yàn))，分低(L)、中(M)、高(H)三個劑量組(10、50、100mg以apoAI含量計(jì))靜脈注射人血漿HDL制劑(每周一次，共計(jì)10周)，從受試動物血中脂質(zhì)和脂質(zhì)過氧化物水平，動脈壁、肝臟脂質(zhì)含量，膽囊膽汁脂質(zhì)含量以及動脈壁AS斑塊面積等方面考查和驗(yàn)證HDL制劑的抗AS作用。
由于沒有與HDL作用機(jī)制完全相同或相似的抗AS藥物，因此發(fā)明人選用調(diào)血脂藥菲諾貝特為陽性對照藥。在陰性對照的選擇上，由于研究已經(jīng)證實(shí)免疫損傷，特別是高脂飼養(yǎng)的模型動物反復(fù)輸注異種蛋白會因發(fā)生免疫反應(yīng)而加速AS的發(fā)生和發(fā)展，而人血漿HDL藥效學(xué)的動物試驗(yàn)不可避免地將會因注射人HDL異種蛋白引起動物的過敏反應(yīng)及免疫反應(yīng)，反而加重高脂飼養(yǎng)的模型動物AS發(fā)生及發(fā)展，為了消除異種蛋白對觀察人血漿HDL制劑在兔AS模型動物中抗AS作用的影響，發(fā)明人除設(shè)置注射生理鹽水的高脂對照(C)組外，還設(shè)置了與HDL中劑量組劑量相當(dāng)?shù)娜搜獫{白蛋白陰性對照(A)組，結(jié)果顯示，用人血漿HDL制劑來防治人類AS疾病不會發(fā)生異種蛋白反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下(1)血脂分析的結(jié)果表明人血漿HDL制劑并不具有使高脂飼養(yǎng)的AS模型動物(實(shí)驗(yàn)性AS預(yù)防及治療試驗(yàn))血脂(膽固醇TC、甘油三酯(TG)以及磷脂(PL)水平降低的作用。因此，HDL抗AS作用不是通過降低血脂(TC、TG)含量來實(shí)現(xiàn)的。
(2)血脂質(zhì)過氧化物測定(實(shí)驗(yàn)性AS預(yù)防試驗(yàn))的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射HDL制劑，低、中、高(L、M、H)三個劑量組血脂質(zhì)過氧化物水平(3.9、2.5、3.2mmol/ml)均比對照組水平(5.4及5.0mmol/ml)顯著降低(P＜0.05，P＜0.01及P＜0.001)，表明人血漿HDL制劑具有對抗高脂飼養(yǎng)的家兔血清脂質(zhì)發(fā)生氧化的作用。
(3)模型動物胸主動脈脂質(zhì)及AS斑塊面積測定發(fā)現(xiàn)，高脂飼養(yǎng)的家兔動脈壁脂質(zhì)含量及AS斑塊面積顯著增加，且以陰性對照(A)組動物最為嚴(yán)重。注射HDL的各組動物動脈壁脂質(zhì)及AS斑塊面積減少或顯著減少，其中以HDL中、高劑量(M、H)組最為明顯。例如預(yù)防試驗(yàn)M、H組動物動脈壁TC、TG含量及AS斑塊面積分別為33.8、35.0、28.1、23.7mg/g干組織以及38.4％(M組)，均比A組動物54.7、38.5mg/g干組織及57.6％顯著減少(P＜0.05)；治療試驗(yàn)的動脈壁脂質(zhì)測定結(jié)果與預(yù)防試驗(yàn)相似，其L、M、H組AS斑塊面積分別為60.2％、58.4％以及53.7％比A組AS斑塊面積79.6％顯著減少(P＜0.01及P＜0.001)。
(4)肝臟脂質(zhì)測定結(jié)果與動脈壁脂質(zhì)測定結(jié)果基本相似。預(yù)防試驗(yàn)動物肝臟TC、TG含量，H組為135.8及44.0mg/g干組織，與A組192.1及72.8(mg/g干組織)比較明顯降低(P＜0.05)；治療試驗(yàn)的結(jié)果更為突出，L、M、H組動物肝臟TC、TG以及PL含量均比A組明顯降低(P＜0.05及P＜0.01)。
(5)膽汁脂質(zhì)含量測定結(jié)果與動脈壁及肝臟脂質(zhì)含量相反，無論是AS預(yù)防或治療試驗(yàn)，注射HDL的各組動物與對照組比較其膽汁脂質(zhì)含量呈增加趨勢，且以預(yù)防試驗(yàn)的結(jié)果最明顯。AS預(yù)防試驗(yàn)H組TC含量(337.5mg％，即每100ml含337.5mg，下同)顯著高于C組(217.2mg％)，M及H組PL含量(978.7及1008.8mg％)顯著高于A組(688.3mg％，P＜0.05)。
上述結(jié)果表明注射人血漿HDL具有使采用高脂飼養(yǎng)的A s模型動物動脈壁、肝臟脂質(zhì)沉積減少、膽汁脂質(zhì)排出增加以及動脈壁AS斑塊面積減小的作用。
本發(fā)明HDL通過給高脂模型家免注射HDL制劑，直接觀察HDL抗AS作用，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論在高脂造型的同時，或高脂造成家兔AS模型以后，注射兔血HDL均可使造型動物動脈壁及肝臟沉積的脂質(zhì)、動脈壁AS斑塊面積顯著減少，充分證實(shí)HDL具有抑制AS發(fā)生并促使AS逆轉(zhuǎn)或消退(即預(yù)防和治療)的雙重作用。因此本發(fā)明HDL在制備預(yù)防和治療AS的新藥方面，有著很好的應(yīng)用前景。
細(xì)菌毒素主要分為外毒素(exotoxin)和內(nèi)毒素(endotoxin)；一些危害人類健康的重要致病菌如白喉和破傷風(fēng)等細(xì)菌的外毒素，隨著其抗毒素和類毒素的相繼研制成功和有效應(yīng)用，已不再使人談虎色變；如今對細(xì)菌毒素的抗?fàn)幰丫劢乖趦?nèi)毒素。
針對內(nèi)毒素血癥的抗內(nèi)毒素治療一直困擾著醫(yī)學(xué)界。盡管采用了日臻完善的器官支持和重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)，以及抗內(nèi)毒素抗體、抗炎性細(xì)胞因子(炎癥介質(zhì))抗體或炎性細(xì)胞因子受體拮抗劑等新藥，但重癥革蘭氏陰性菌感染引起的內(nèi)毒素血癥所致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)以及由此而來的多臟器功能障礙綜合癥(MODS)，其病死率卻一直居高不下。因此，內(nèi)毒素依然是一大醫(yī)學(xué)難題。
內(nèi)毒素在機(jī)體內(nèi)的吞噬、降解和清除，有賴于免疫系統(tǒng)的積極參與；此外，機(jī)體內(nèi)完善的解毒機(jī)制對內(nèi)毒素的脫毒亦發(fā)揮了重要作用。機(jī)體的免疫和解毒系統(tǒng)在很多場合下既相互重疊或相互聯(lián)系，又相互區(qū)別。內(nèi)毒素進(jìn)入人體后，血液中的脂蛋白，特別是高密度脂蛋白等參與脂質(zhì)交換和轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白成分首當(dāng)其沖地對內(nèi)毒素予中和緩沖作用，血液的中性粒細(xì)胞釋放某些陽離子蛋白(如殺菌通透性增加蛋白)對內(nèi)毒素予脫毒解聚作用，組織中廣泛分布的堿性磷酸酶還可對內(nèi)毒素予去磷酸化作用，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)則對內(nèi)毒素予吞噬降解作用，由此形成機(jī)體對內(nèi)毒素的解毒過程。所以，脂蛋白，特別是高密度脂蛋白具有保護(hù)機(jī)體解毒功能的作用，其在制備預(yù)防和治療中和細(xì)菌毒素、以及多器官功能障礙綜合癥MODS新藥方面，有著很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明利用低溫乙醇法生產(chǎn)人血漿白蛋白和丙種球蛋白以后廢棄的FIV-1沉淀為原料，在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過分離純化步驟，從FIV-1中提取HDL制品，提供了大規(guī)模制備人血漿HDL的低溫乙醇新工藝方法，并且成功制備了安全、穩(wěn)定、無毒、無熱原、無菌及無病毒污染、pH 6.4～7.4、載脂蛋白AI含量≥0.5％、HDL純度≥95％、含10％±1％蔗糖的供靜脈輸注的人血HDL制劑，脂質(zhì)及載脂蛋白組成及含量分析表明，HDL制品的脂質(zhì)及載脂蛋白組成與含量與天然HDL值基本一致，且不含可以促使動脈粥樣硬化發(fā)生的低密度脂蛋白(LDL)及極低密度脂蛋白(VLDL)，是對寶貴人血資源的充分利用。


圖1為富含HDL的FIV-1沉淀制備過程(cohn氏6法，1946)E乙醇濃度T溫度γ/2離子強(qiáng)度P蛋白濃度圖2為HDL精制工藝流程圖3為HDL免疫電泳結(jié)果，其中1.正常人血漿2.羊抗人apoAI抗血清3.HDL制品圖4為HDL脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中1.正常人血漿2.HDL制品圖5為HDL制劑SDS-PAGE結(jié)果，其中1、2、4、5、6、7為HDL制品3為分子量標(biāo)準(zhǔn)圖6為HDL生物活性酶聯(lián)免疫檢測法程序圖7為人血HDL生物活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中■—■HDL
●—●LDL▲—▲VLDL具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取原料血漿1000L，加入50％乙醇190.5L，調(diào)節(jié)pH值為7.1，蛋白濃度5.6％，離子強(qiáng)度為0.15，在-2℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1190 L，沉淀12Kg；向上清滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液5000mL，使混合液pH為6.90，加入95％乙醇263L，使蛋白濃度為3.4％，離子強(qiáng)度為0.09，在-4℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1450L，沉淀40Kg；向上清液中補(bǔ)加注射用水682L，滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液14.8L，使pH為4.9，蛋白濃度為1.7％，離子強(qiáng)度為0.15，在-4℃下攪拌2小時，靜置2小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀10.2Kg；向沉淀中加入30mmol/L氯化鈉溶液20.4L，滴加1mol/LNaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為5.5，在0℃下攪拌4小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，除去其它血漿蛋白及可溶的雜蛋白，得沉淀4.65Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液465L溶解，使溶解液pH為5.21，滴加1mol/LNaHCO3溶液400ml，調(diào)節(jié)溶解液pH值為7.02，在7℃下攪拌6小時，過濾，得濾液600L；向?yàn)V液中滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合液120ml，使反應(yīng)液pH為5.15，在2℃下攪拌1小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀3.95Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液395L，此時溶解液pH為5.15，滴加1mol/LNaHCO3溶液350ml，使溶解液pH為7.00，在2℃下攪拌6小時，過濾，得濾液510L；使用8-10KD超濾膜超濾，濃縮，得濃縮液380L，濃縮液中加入38Kg蔗糖，蛋白濃度為18g/L，乙醇含量為0.02％，電導(dǎo)率為0.4Ms；在微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL，apoAI含量為88％，apoAI的回收率為71％。
除菌分裝成品50ml×7550瓶，并于2℃保存。
實(shí)施例2取原料血漿1000L，加入50％乙醇190.5L，調(diào)節(jié)pH值為7.3，蛋白濃度5.2％，離子強(qiáng)度為0.18，在-2℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1100L，沉淀12Kg；向上清滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液5000mL，使混合液pH為6.90，加入95％乙醇243L，使蛋白濃度為4.0％，離子強(qiáng)度為0.15，在-6℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1449L，沉淀39Kg；向上清液中補(bǔ)加注射用水682L，滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液14.8L，使pH為5.0，蛋白濃度為2.0％，離子強(qiáng)度為0.09，在-5℃下攪拌2小時，靜置2小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀9.8Kg；向沉淀中加入30mmol/L氯化鈉溶液19.6L，滴加1mol/LNaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為5.6，在2℃下攪拌4小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀4.42Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液442L溶解，使溶解液pH為5.20，滴加1mol/L NaHCO3溶液410ml，調(diào)節(jié)溶解液pH值為7.1，在8℃下攪拌6小時，過濾，得濾液610L；向?yàn)V液中滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合液130ml，使反應(yīng)液pH為5.20，在3℃下攪拌1小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀3.80Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液380L，此時溶解液pH為5.17，滴加1mol/L NaHCO3溶液360ml，使溶解液pH為7.10，在6℃下攪拌7小時，過濾，得濾液500L；使用8-10KD超濾膜超濾，濃縮，得濃縮液390L，濃縮液中加入39Kg蔗糖，蛋白濃度為19g/L，乙醇含量為0.02％，電導(dǎo)率為0.45Ms；在微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL，apo AI含量為77％，apo AI的回收率為78％。
除菌分裝成品50ml×7850瓶，并于4℃保存。
實(shí)施例3
取原料血漿1000L，加入50％乙醇190.5L，調(diào)節(jié)pH值為6.8，蛋白濃度4.0％，離子強(qiáng)度為0.10，在-2℃下攪拌2小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1190L，沉淀13Kg；向上清滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液5000mL，使混合液pH為6.90，加入95％乙醇263L，使蛋白濃度為2.0％，離子強(qiáng)度為0.05，在-6℃下攪拌2小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1450L，沉淀38Kg；向上清液中補(bǔ)加注射用水658L，滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液14.3L，使pH為4.5，蛋白濃度為1.0％，離子強(qiáng)度為0.05，在-3℃下攪拌2小時，靜置2小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀10.1Kg；向沉淀中加入30mmol/L氯化鈉溶液20.2L，滴加1mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為5.15，在0℃下攪拌4小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀4.51Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液451L溶解，使溶解液pH為5.18，滴加1mol/LNaHCO3溶液390ml，調(diào)節(jié)溶解液pH值為7.02，在5℃下攪拌6小時，過濾，得濾液560L；向?yàn)V液中滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合液110ml，使反應(yīng)液pH為5.15，在2℃下攪拌1小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀3.75Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液375L，此時溶解液pH為5.15，滴加1mol/LNaHCO3溶液330ml，使溶解液pH為7.00，在2℃下攪拌6小時，過濾，得濾液500L；使用8-10KD超濾膜超濾，濃縮，得濃縮液370L，濃縮液中加入37Kg蔗糖，蛋白濃度為18g/L，乙醇含量為0.03％，電導(dǎo)率為0.5Ms；在微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL，apo AI含量為81％，apo AI的回收率為69％。
除菌分裝成品50ml×7350瓶，并于6℃保存。
實(shí)施例4取原料血漿1000L，加入50％乙醇190.5L，調(diào)節(jié)pH值為7.4，蛋白濃度6.0％，離子強(qiáng)度為0.2，在-2℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1250L，沉淀13.8Kg；向上清滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液5050mL，使混合液pH為6.95，加入95％乙醇272L，使蛋白濃度為4.0％，離子強(qiáng)度為0.15，在-6℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1580L，沉淀45Kg；向上清液中補(bǔ)加注射用水743L，滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液16.1L，使pH為5.5，蛋白濃度為2.0％，離子強(qiáng)度為0.15，在-6℃下攪拌2小時，靜置2小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀10.3Kg；向沉淀中加入30mmol/L氯化鈉溶液20.6L，滴加1mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為5.0，在0℃下攪拌4小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀4.61Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液461L溶解，使溶解液pH為5.15，滴加1mol/L NaHCO3溶液420ml，調(diào)節(jié)溶解液pH值為7.7，在10℃下攪拌6小時，過濾，得濾液620L；向?yàn)V液中滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合液130ml，使反應(yīng)液pH為5.25，在2℃下攪拌1小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀3.92Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液392L，此時溶解液pH為5.16，滴加1mol/LNaHCO3溶液360ml，使溶解液pH為7.09，在8℃下攪拌8小時，過濾，得濾液560L；使用8-10KD超濾膜超濾，濃縮，得濃縮液400L，濃縮液中加入40Kg蔗糖，蛋白濃度為19.5g/L，乙醇含量為0.02％，電導(dǎo)率為0.3Ms；在微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL，apo AI含量為85％，apo AI的回收率為75％。
除菌分裝成品50ml×7900瓶，并于8℃保存。
實(shí)施例5取原料血漿1000L，加入50％乙醇190.5L，調(diào)節(jié)pH值為7.2，蛋白濃度5.5％，離子強(qiáng)度為0.19，在-2℃下攪拌2小時，靜置7小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1300L，沉淀14Kg；向上清滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液5090mL，使混合液pH為6.50，加入95％乙醇287L，使蛋白濃度為3.8％，離子強(qiáng)度為0.12，在-5℃下攪拌2小時，靜置8小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，得上清1600L，沉淀49Kg；向上清液中補(bǔ)加注射用水752L，滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合溶液16.3L，使pH為5.1，蛋白濃度為1.9％，離子強(qiáng)度為0.08，在-4℃下攪拌2小時，靜置2小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀10.2Kg；向沉淀中加入30mmol/L氯化鈉溶液20.4L，滴加1mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH為6.0，在2℃下攪拌4小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀4.58Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液458L溶解，使溶解液pH為5.19，滴加1mol/LNaHCO3溶液410ml，調(diào)節(jié)溶解液pH值為7.12，在8℃下攪拌6小時，過濾，得濾液600L；向?yàn)V液中滴加pH為4.0的HAC/NaAC混合液115ml，使反應(yīng)液pH為5.21，在2℃下攪拌1小時，靜置6小時，使用142型連續(xù)離心機(jī)，在14000r/min下離心，棄上清，得沉淀3.85Kg；向沉淀中加入160mmol/L氯化鈉溶液385L，此時溶解液pH為5.20，滴加1mol/LNaHCO3溶液360ml，使溶解液pH為7.70，在4℃下攪拌8小時，過濾，得濾液570L；使用8-10KD超濾膜超濾，濃縮，得濃縮液415L，濃縮液中加入41.5Kg蔗糖，蛋白濃度為19.3g/L，乙醇含量為0.03％，電導(dǎo)率為0.5Ms；在微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL，apo AI含量為78％，apo AI的回收率為73％。
除菌分裝成品50ml×8150瓶，并于5℃保存。
實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例為本發(fā)明產(chǎn)品HDL的檢定數(shù)據(jù)。
1、方法1.1 HDL的鑒定及純度分析采用免疫電泳及脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳鑒定制備的HDL，并根據(jù)脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果掃描分析其純度。
1.2蛋白質(zhì)含量測定采用Markwell等的改良Lowry法進(jìn)行測定。
1.3脂質(zhì)及載脂蛋白含量測定HDL中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)采用北京中生北控生物科技股份有限公司酶法試劑盒測定，磷脂(PL)采用改良抗壞血酸還原法測定。載脂蛋白(apo)AI、AII、B100、CII、CIII、E采用四川大學(xué)華西載脂蛋白研究室免疫單向擴(kuò)散試劑盒測定。
1.4 apoAI分子量測定采用SDS-PAGE法進(jìn)行測定。
1.5 HDL生物活性測定采用徐燕華等建立的人血HDL生物活性測定法進(jìn)行測定。按每1μg apoAI為1個HDL活性單位(U)。
1.6無菌檢查按《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄“無菌檢查法”進(jìn)行。
1.7細(xì)菌內(nèi)毒素檢查按《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行。
1.8熱原檢查按《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄“熱原檢查法”進(jìn)行。
1.9異常毒性檢查按《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄“異常毒性檢查法”進(jìn)行2、結(jié)果2.1 HDL的鑒定及純度分析(1)免疫電泳，見圖3；由圖3可見，HDL制品與正常人血漿在相同位置出現(xiàn)沉淀線。
(2)脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳，見圖4；由圖4可見，HDL制品在脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)一條區(qū)帶，Biorad凝膠成像掃描系統(tǒng)掃描分析，其純度為100％。
2.2 HDL中脂質(zhì)及載脂蛋白組成(％)，見下表；由下表可見，本發(fā)明HDL制品apoAI含量較高。

2.3 apoAI分子量測定，見圖5，其分子量為27.7KD；2.4 HDL制劑生物活性測定，見下表


實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例為人血HDL抗AS生物活性測定方法的研究，內(nèi)容如下1、材料及試劑閂本大耳白兔；正常人血漿采自獻(xiàn)血員人血漿HDL制劑，按本發(fā)明所述方法制備；HRP(RZ＝3.0)，Sigma公司產(chǎn)品；純化兔肝細(xì)胞膜、羊抗人apoAI IgG、HRP-抗apoAI IgG、人LDL及VLDL，自制；TG、TC酶法測定試劑盒，北京中生北控生物科技股份有限公司；載脂蛋白AI、B100、CII、CIII及E免疫單向擴(kuò)散試劑盒，四川大學(xué)華西載脂蛋白研究室；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，Corning公司產(chǎn)品；Model 550型酶標(biāo)儀，Bio-RAD公司產(chǎn)品；L8-55型超速離心機(jī)，Beckman公司；Sebris掃描儀，Sebris公司產(chǎn)品。
包被緩沖液為pH 9.6，50mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液；洗滌及稀釋緩沖液為pH 7.4，含0.05％Tween-20的20mmol/L PBS；酶反應(yīng)基質(zhì)液為pH 5.6，含0.04％鄰苯二胺、0.05％H2O2的0.1mol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(臨用前配制)。
2、方法2.1兔肝細(xì)胞膜的制備按蔗糖密度梯度超速離心法純化兔肝細(xì)胞膜。收集37％～41％蔗糖密度界面膜成分，用緩沖液(50mmol/LTris-HCl，100mmol/L NaCl，0.5mmol/LCaCl2，pH7.5)稀釋后，于27000×g離心20分鐘。收集沉淀，加少量緩沖液，用MSE-150型超聲波儀于冰浴中處理2×10秒，振幅14。制備的肝細(xì)胞膜分裝于-70℃保存。膜產(chǎn)率為1.5～2.0mg/g濕肝組織，與肝勻漿比較，5′-核苷酸酶活力提高6～10倍。
2.2 LDL及VLDL制各按一次性密度梯度離心法分離人血漿脂蛋白收集d＝1.030～1.050g/mL的LDL組分及d＝0.95～1.006g/mL的VLDL組分，對10mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，pH7.4的緩沖液透析脫鹽，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 膜蛋白及脂蛋白均用Markwell等的方法測定蛋白質(zhì)含量。
2.3 HDL(實(shí)施例2)的處理以本發(fā)明實(shí)施例2得到的人血HDL制劑為原料，超濾濃縮后按Havel等超速離心法制備。制備時HDL制劑用固體NaBr調(diào)密度至1.21g/mL，于L8-55型超速離心機(jī)50000rpm、10℃離心24小時。收集上層d≤1.21g/mL組分，透析，除菌分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?br> HDL(實(shí)施例2)TG及TC含量采用酶法試劑盒測定；磷脂(PL)采用抗壞血酸還原法測定；apoAI、AII、B100、CII、CIII及E含量采用免疫單向擴(kuò)散試劑盒測定。
2.4 HDL生物活性檢測試驗(yàn)2.4.1測定步驟按HDL受體酶聯(lián)免疫檢測法程序進(jìn)行，見圖6；測定時，膜蛋白的包被濃度及HRP-抗apoAI IgG的稀釋度，按棋盤滴定法確定分別為25μg膜蛋白/ml及1∶250。
2.4.2 HDL生物活性標(biāo)準(zhǔn)曲線以制備的HDL(實(shí)施例2)為標(biāo)準(zhǔn)，按每1μg apoAI為1個HDL活性單位(U)，將HDL參考品用稀釋液稀釋成80、40、20、10及5(U/mL)，再按上述步驟測定，繪出光吸收值與HDL生物活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的雙對數(shù)回歸方程。
2.4.3樣品測定待測樣品稀釋后，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同一酶標(biāo)板內(nèi)測定其光吸收值。最后以標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算HDL制劑的活性單位。
3、結(jié)果3.1 HDL(實(shí)施例2)的鑒定3.1.1 HDL(實(shí)施例2)脂質(zhì)及載脂蛋白組成，見下表

由上表可見，HDL(實(shí)施例2)apoAI含量高于HDL文獻(xiàn)值。
3.1.2脂蛋白預(yù)染電泳HDL(實(shí)施例2)呈現(xiàn)一條區(qū)帶，Sebris掃描儀掃描分析，其純度為99.8％。
3.1.3免疫電泳見圖3。HDL(實(shí)施例2)與正常人血清在相同位置出現(xiàn)沉淀線。
3.2 HDL生物活性標(biāo)準(zhǔn)曲線HDL標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明，492nm處光吸收值與HDL活性單位數(shù)的對數(shù)，在1～16個活性單位范圍內(nèi)呈直線關(guān)系，見圖7。
3.3特異性試驗(yàn)由圖7可見，用肝細(xì)胞膜包被的酶標(biāo)板，純化的人LDL及VLDL對酶-抗體交聯(lián)物無競爭性作用，表明人LDL及VLDL與酶-抗體交聯(lián)物無交叉反應(yīng)。
3.4重復(fù)性試驗(yàn)3.4.1板內(nèi)重復(fù)性同一HDL制劑，分別稀釋250及500倍，測得板內(nèi)變異系數(shù)分別為7.6％及9.5％(n＝10)。
3.4.2板間重復(fù)性三塊酶標(biāo)板分別測定同一HDL制劑(250倍稀釋)，3日內(nèi)測完，測得板間變異系數(shù)為12.3％。
實(shí)驗(yàn)例3本實(shí)驗(yàn)例為HDL制劑抗AS生物活性穩(wěn)定性試驗(yàn)。
在2～8℃、25℃及40℃分別放置實(shí)施例1制備的HDL制劑，定期取樣，并測定其pH值、apoAI含量及抗AS生物活性，觀察存放溫度及存放時間對HDL制劑抗AS生物活性的影響。結(jié)果見下表

由上表可見，在2～8℃下放置18個月及25℃下放置5個月，HDL制劑抗AS生物活性均沒有明顯變化，而在40℃下放置一個月時，其抗AS生物活性即明顯降低；表明在低溫條件(2～8℃)下，HDL制劑抗AS生物活性可以長時間保持穩(wěn)定，而在高溫(40℃)條件下，HDL制劑抗AS生物活性會明顯下降；所以，HDL制劑的適合環(huán)境溫度為2-8℃。
實(shí)驗(yàn)例4本實(shí)驗(yàn)例說明本發(fā)明HDL制劑具有對抗內(nèi)毒素血癥的作用。
取正常200只兔，隨機(jī)分組，每組100只，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。
對兩組兔注射內(nèi)毒素(2ng/kg)造成內(nèi)毒素血癥。
在注射內(nèi)毒素前3.5小時，先給實(shí)驗(yàn)組靜脈滴注實(shí)施例3制備的HDL制劑(10mg/kg，以apoAI含量計(jì))，30分鐘滴完。
10小時后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-6等炎性介質(zhì)的釋放較小，且實(shí)驗(yàn)組兔感染癥狀較輕，表明靜脈滴注HDL具有對抗內(nèi)毒素血癥的作用，見下表

與對照組比較P＜0.05本實(shí)驗(yàn)例充分證實(shí)本發(fā)明HDL制劑具有對抗內(nèi)毒素血癥的作用。本發(fā)明人研究認(rèn)為，HDL分子外殼的磷脂層能夠與內(nèi)毒素分子中的類脂A緊密結(jié)合，結(jié)合后的內(nèi)毒素不再與CD14受體結(jié)合，因而阻斷了內(nèi)毒素刺激單核/巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)例5本實(shí)驗(yàn)例說明HDL治療能夠有效降低多臟器功能障礙綜合癥(MODS)患者炎性介質(zhì)。
1、目的比較HDL治療、連續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)對MODS患者炎性介質(zhì)(白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等)的治療效果。
2、方法選取表現(xiàn)為MODS的危重病患者40例，MODS診斷符合美國危重病協(xié)會1992年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊甙慈朐合群箜樞螂S機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，單號為實(shí)驗(yàn)組，20例，實(shí)驗(yàn)組患者接受HDL治療；雙號為對照組，20例，接受連續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)治療。兩組分別在診斷MODS當(dāng)時及治療24小時后抽血待檢。
3、測定(放免藥盒購自中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所)白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6(IL-1β、IL-6)測定取靜脈血2ml，注入試管中待凝固后，分離血清，放-20℃低溫保存，采用平衡法一次監(jiān)測；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采靜脈血2ml，以10％EDTA二鈉作抗凝劑，分離血漿后，放-20℃低溫保存，采用液相競爭法一次監(jiān)測。
4、結(jié)果實(shí)驗(yàn)組患者經(jīng)HDL治療24小時后，白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α明顯低于對照組。見下表

與對照組比較P＜0.01
全身炎癥反應(yīng)(SIR)是MODS發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)，當(dāng)機(jī)體遭受感染或創(chuàng)傷等嚴(yán)重打擊后細(xì)菌/毒素或組織損傷將刺激機(jī)體巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)(腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6等)，腫瘤壞死因子是最早釋放的炎性介質(zhì)之一，可進(jìn)一步刺激和激活巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，釋放大量的炎性介質(zhì)，形成炎性介質(zhì)介導(dǎo)的“瀑布樣”連鎖反應(yīng)，猶如多米諾骨牌逐級放大，使炎性反應(yīng)失控。若不有效阻斷其發(fā)展，將導(dǎo)致多臟器功能不全綜合癥(MODS)，甚至多臟器系統(tǒng)功能衰竭(MOSF)，而致病人死亡。
本實(shí)驗(yàn)例證實(shí)HDL治療可以顯著降低多臟器功能障礙綜合癥患者腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6等炎性介質(zhì)濃度，有效降低病人死亡率。
權(quán)利要求
1.一種人血高密度脂蛋白，其特征在于，該高密度脂蛋白中apo AI的含量為77-88％和/或人血高密度脂蛋白中apoAI分子量為27.7KD。
2.一種人血高密度脂蛋白產(chǎn)品，其特征在于，所述的人血高密度脂蛋白產(chǎn)品中含有0.1-99％的人血高密度脂蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血高密度脂蛋白產(chǎn)品，其特征在于，所述的人血高密度脂蛋白產(chǎn)品為靜脈注射劑，其中含有9～11％蔗糖和/或0.5％白蛋白和/或150mg±1mg/L維生素C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人血高密度脂蛋白產(chǎn)品，其特征在于，所述的人血高密度脂蛋白中apo AI的含量為77-88％和/或人血高密度脂蛋白中apoAI分子量為27.7KD。
5.一種人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品的制造方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.取原料血漿，加入1/5～1/4體積的50％乙醇，調(diào)節(jié)pH值為6.8-7.4，在-4～-2℃下攪拌1-3小時，靜置6-8小時，離心，得上清；向上清滴加緩沖溶液至混合液pH為6.5-7.0，加入1/5～1/4混合液體積的95％乙醇，在-6～-4℃下攪拌1-3小時，靜置6-8小時，離心，得上清；向上清液中補(bǔ)加45-50％體積的注射用水，滴加緩沖溶液使pH為4.5-5.5，在-6～-3℃下攪拌1-3小時，靜置1-3小時，離心，棄上清，得沉淀；B.沉淀用2-3倍重量的0.02～0.1M NaCl溶液溶解，調(diào)pH至5.2±0.5后，在0～2℃下攪拌2-6小時，然后離心得沉淀；沉淀用50-150倍重量的0.1～0.2M NaCl溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液pH為7.2±0.5，在2～8℃下攪拌6-20小時，過濾得濾液；C.上述濾液加入緩沖液，使pH為5.2±0.5，攪拌1-3小時，在2～4℃下，靜置6-20小時，離心收集沉淀；沉淀用50～150倍量的0.1～0.2M NaCl溶液溶解，調(diào)pH至7.2±0.5，攪拌使沉淀完全溶解，過濾，得濾液；D.濾液用超濾膜超濾，脫鹽并濃縮，得富含HDL的溶液，經(jīng)后處理，得HDL及其產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述方法中調(diào)節(jié)pH使用1mol/LNaHCO3溶液和/或所述的緩沖液為pH＝4的HAC/NaAC緩沖體系。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述步驟C結(jié)束后重復(fù)一遍。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述步驟D中的超濾膜為8-70KD超濾膜；優(yōu)選使用30～50KD超濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述步驟D所述的后處理可以是超濾濃縮液加9～11％注射用蔗糖或0.5％白蛋白，按每升加入150mg±1mg注射用維生素C，調(diào)pH至7.2±0.5，得HDL溶液；上述HDL溶液于微機(jī)自控的巴氏滅菌器內(nèi)60±1℃、10小時滅活病毒；滅活病毒后的HDL溶液，除菌分裝，并于2～8℃保存。
10.權(quán)利要求1-9所述人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品在制備治療多器官功能障礙綜合癥(MODS)；或制備心血管系統(tǒng)疾病，如動脈粥樣硬化(AS)的藥物；或制備中和細(xì)菌毒素等急性癥狀藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品，以及其制造方法和應(yīng)用。所述的人血高密度脂蛋白中，apoAI含量為77－88％。本發(fā)明以低溫乙醇法生產(chǎn)人血漿白蛋白和丙種球蛋白以后廢棄的FIV－1沉淀為原料，通過分離純化步驟，從FIV－1中提取HDL，提供了大規(guī)模制備人血漿HDL的低溫乙醇新工藝方法，并且制成可供靜脈輸注的人血HDL制劑，是對寶貴人血資源的充分利用。本發(fā)明涉及的人血高密度脂蛋白及其產(chǎn)品在制備治療多器官功能障礙綜合癥(MODS)、心血管系統(tǒng)疾病，如動脈粥樣硬化(AS)以及中和細(xì)菌毒素等急性癥狀藥物方面有著很好的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/47GK1699419SQ200510077280
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者江永忠, 陳愛民, 周潮, 樊紹文 申請人:江永忠, 陳愛民, 周潮, 樊紹文