具有抗耐藥性的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽及其合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有很好的抗耐藥菌活性的組合抗菌 肽，尤其涉及一種具有抗耐藥性的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽及其制備合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，濫用抗生素產(chǎn)生的耐藥性問題日益嚴重，對人類疾病造成了巨大的威脅。 尋找新的可替代抗生素的新藥迫在眉睫?？咕模ˋntimicrobial peptides)，是生物體 經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的小分子多肽，來源廣泛，其分子量小，大約在3~6 kD之 間，有耐熱、耐酸性強，水溶性好，快速的殺菌能力等特點（Hancock REW，Scott MG. Proc Natl AcadSci USA，2000,97 (16):8856~ 8861)?？咕牡目咕鷻C制不同于普通抗生素，抗 菌機制一般包括①快速破壞菌膜，使菌體內(nèi)容物泄露，細菌死亡②抗菌肽與細菌細胞內(nèi)容 物(如DNA或RNA)作用，干擾細菌細胞正常的合成和代謝，導(dǎo)致菌體死亡(劉立偉，鄧磊.抗 菌肽作用機制研宄進展[J].河北化工，2012, 35 (7) :13-15)。所以，抗菌肽不易誘導(dǎo)耐藥 性的產(chǎn)生，使其成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱門研宄內(nèi)容。但是，部分天然抗菌肽也存在抗菌活性 弱，對耐藥菌作用無效等缺點，將限制抗菌肽的發(fā)展。
[0003] 點擊化學(xué)主要用于研發(fā)和制造可用于醫(yī)學(xué)診斷和新藥開發(fā)的新型生化標(biāo)記 物。目前，它被認為是一項非常理想的技術(shù)，已經(jīng)被應(yīng)用于藥物開發(fā)。點擊化學(xué)的代表 是Cu催化的疊氮基和炔基的1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)。產(chǎn)物有1，4-二取代-1，2, 3-三唑 結(jié)構(gòu)，其中1，4-二取代-1，2, 3-三唑結(jié)構(gòu)被認為是一種新型的藥效團，有極大地潛力可 以將其運用到抗癌，抗菌，HIV酶抑制劑等研宄中（Agalave SG, Maujan SR, Pore VS，ei al. Click chemistry: I, 2, 3-triazoles as pharmacophores [J]. Chem Asian J, 2011, 6(10) :2696-2718.)。有報道將抗菌肽以點擊化學(xué)的方法進行側(cè)鏈連接有助于提高抗菌 肽對細胞膜的穿透能力（Christopher J.etal, Enhanced Membrane Pore Formation by Multimeric/Oligomeric Antimicrobial Peptides,Biochemistry 2007, 46, 13437-13442)。因此，我們采用點擊化學(xué)的方法，用1，2, 3-三唑結(jié)構(gòu)作為鏈接子，側(cè)鏈鏈接 抗菌肽，合成出抗菌活性增強的新型組合抗菌肽，以期具有良好的抗耐藥菌活性，擴寬抗菌 譜的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有新型結(jié)構(gòu)的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽； 本發(fā)明的另一目的是提供一種上述含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽的合成方法。
[0005] -、具有抗耐藥性的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽 本發(fā)明具有抗耐藥性的組合抗菌肽的結(jié)構(gòu)式如下所示：
二、具有抗耐藥性的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽的制備 本發(fā)明具有抗耐藥性的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽的制備方法，是以含炔丙基甘 氨酸和疊氮基賴氨酸的前體肽為底物，以CuSO4. 5H20為催化劑，以抗壞血酸鈉為抗氧化劑， 以水-叔丁醇為混合溶劑，采用點擊化學(xué)的1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)24~28小時，產(chǎn)生一個 1，4-二取代-1片1，2, 3-三唑結(jié)構(gòu)將上述前體肽鏈接而得。
[0006] 所述含炔丙基甘氨酸的前體肽序列為AC-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Th 1-1^11-1^11-順2或 AC-Pra-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-NH2;含塊丙基甘氨酸（Pra)和含疊氮 基賴氨酸[Lys(N 3)]的前體肽的摩爾比為2。
[0007] 催化劑CuSO4. 5H20的用量為疊氮基賴氨酸的前體肽摩爾量的5~10倍。
[0008] 抗氧化劑抗壞血酸鈉的用量為疊氮基賴氨酸的前體肽摩爾量的15~25倍。
[0009] 混合溶劑水-叔丁醇中，水與叔丁醇的體積比為1:0. 1~1:10。
[0010] 上述反應(yīng)式如下：

圖1、2分別為上述方法合成的含三唑結(jié)構(gòu)鏈接子的組合抗菌肽J-AR、J-RR的質(zhì)譜圖。 J-AR和J-RR的分子量等于它們各自前體肽分子量之和，經(jīng)計算為J-AR的分子量為2492， J-RR的分子量為2342,從圖1、2可以看出，J-AR和J-RR的分子量和我們理論計算的結(jié)果 一致，證明我們合成的產(chǎn)物與我們設(shè)計的抗菌肽結(jié)構(gòu)一致。
[0011] 三、目標(biāo)肽J-AR和J-RR的體外抑菌實驗 1.對標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌實驗 采用常見的二倍稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度，即MIC值。結(jié)果重復(fù)三次以上的、平 行實驗。結(jié)果見表1。
[0012] 2.對耐藥菌株的最低抑菌濃度 采用常見的二倍稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度，即MIC值。結(jié)果重復(fù)三次以上的、平 行實驗。結(jié)果見表2。
[0013] 表1、2的結(jié)果表明，新型組合抗菌肽J-AR和J-RR抗菌活性顯著提高，同時產(chǎn)生良 好的對抗耐藥菌的活性，對臨床分離的耐藥菌株均不產(chǎn)生耐藥性。臨床上常見的抗生素作 用耐藥菌均出現(xiàn)耐藥性，對其不產(chǎn)生抗菌作用。
[0014] 3.組合抗菌肽J-AR、J-RR的掃描電鏡試驗 該方法可以從形態(tài)學(xué)上直觀的觀察抗菌肽作用于細菌后其對細菌細胞膜的作用效果。 圖1為大腸桿菌掃描電鏡：A) Anoplin組、B) RW組、C) J-AR組、D) J-RR組、E)陰性對照 組(大腸桿菌)。圖3的結(jié)果顯示，組合鏈接后并不改變母肽原有的破膜機制，當(dāng)其與菌作用 時，造成菌膜形態(tài)發(fā)生變形凹陷，細菌內(nèi)容泄露，菌體死亡。
[0015] 綜上所述，經(jīng)過生物活性篩選結(jié)果顯示，本發(fā)明合成的目標(biāo)物組合抗菌肽J-AR、 J-RR具有很強的抗菌活性，對測試的標(biāo)準(zhǔn)的菌株具有很強的抗菌活性，而且對臨床分離的 耐藥菌株也有強的抗菌活性。同時掃描電鏡實驗觀察側(cè)鏈鏈接組合抗菌肽可以引起大腸桿 菌菌膜的破壞。因此，含三唑鏈接子的新型組合抗菌肽具有優(yōu)良的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為J-AR的質(zhì)譜圖。
[0017] 圖2為J-RR的質(zhì)譜圖。
[0018] 圖3為不同抗菌肽的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
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