一種寬裂解譜沙門氏菌噬菌體及其抑菌應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株噬菌體及其抑菌應(yīng)用，尤其是一種寬裂解譜沙門氏菌噬菌體及其 抑菌應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌（Salmonella)為革蘭氏陰性直桿菌，是一種重要的人畜共患病原菌。國 內(nèi)外研究表明，由沙門氏菌引起的食源性疾病屢居前位。隨著抗生素的大量和長期使用，在 食品和環(huán)境中，日趨嚴(yán)重的耐藥型沙門氏菌已影響人類感染沙門氏菌疾病的治療，能否研 究出新型的生物抑菌劑來替代化學(xué)抗生素是目前科研人員面臨的一個挑戰(zhàn)。
[0003] 噬菌體是一類細(xì)菌病毒，烈性噬菌體感染細(xì)菌后，能夠快速裂解細(xì)菌導(dǎo)致宿主菌 的死亡。沙門氏菌噬菌體可以特異性感染并裂解沙門氏菌，因而具有殺菌作用。在感染模 型中，噬菌體能夠特異性殺死沙門氏菌，而在食品中，噬菌體能夠作為抗菌劑來控制細(xì)菌污 染，具有潛在的開發(fā)價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種寬裂解譜沙門氏菌噬菌體，對沙門氏菌具有強(qiáng)裂解作用的噬菌體 制劑，該制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性的滅活多種沙門氏菌，為目前防控沙門氏菌 污染提供一種安全、無毒副作用的噬菌體產(chǎn)品來源。
[0005] 本發(fā)明還提供一種所述寬裂解譜沙門氏菌噬菌體的抑菌應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種寬裂解譜沙門氏菌噬菌體，保藏號為：CCTCCNO:M2014145,保藏日期為 2014年4月24日，該噬菌體對沙門氏菌有強(qiáng)的裂解作用。在本發(fā)明中，該株噬菌體從電鏡 形態(tài)上分析，屬于肌尾噬菌體科，將其命名為沙門氏菌噬菌體STP4-a;在40-60°C和pH為 4-12的條件下都能夠存活；-20°C保存1年后活性穩(wěn)定；噬菌體保存的保護(hù)劑為含20%甘 油的培養(yǎng)溶液。
[0008] -種所述噬菌體在制備殺滅沙門氏菌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：將沙門氏菌 噬菌體純化后，用于抑制和殺滅沙門氏菌。
[0009] 該噬菌體用于防止沙門氏菌污染和沙門氏菌過度生長，其中所述的沙門氏菌包括 鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和乙型傷寒沙門氏 菌。
[0010] 一種所述的寬裂解譜沙門氏菌噬菌體在防治食品污染沙門氏菌方面的應(yīng)用。
[0011] 將噬菌體用水稀釋后，作為噴灑液或淋洗液，用于對食品的生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)器具 或生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行噴灑消殺，用于控制沙門氏菌對所述的環(huán)境或器具或設(shè)備的污染。
[0012] 所述食品是指：由糧食、肉類、蔬菜、蛋類中擇一的加工制品，或由它們組合的加工 制品。
[0013] 一種含有所述的寬裂解譜沙門氏菌噬菌體的噬菌體制劑。該噬菌體制劑對沙門氏 菌具有強(qiáng)裂解作用，該制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性的滅活多種沙門氏菌，為目前 防控沙門氏菌污染提供一種安全、無毒副作用的噬菌體產(chǎn)品來源。
[0014] 當(dāng)噬菌體以109pfu/g飼料的添加量添加到雞飼料中，可使雞腸道內(nèi)沙門氏菌的數(shù) 量降低1個數(shù)量級，抑菌效果顯著，對其他細(xì)菌則沒有影響。
[0015] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：采用噬菌體特異性裂解沙門氏菌可以殺死具有耐 藥性的沙門氏菌。
【附圖說明】
[0016] 圖1為噬菌體電鏡照片（X40K);
[0017] 圖2為噬菌體溫度敏感性檢測結(jié)果；
[0018] 圖3為噬菌體pH敏感性檢測結(jié)果；
[0019]圖4為噬菌體保存溫度分析圖；
[0020] 圖5為不同組小鼠肝臟組織切片圖（H.EX400);
[0021] 圖6為不同組小鼠脾臟組織切片圖（H.EX200);
[0022] 圖7為不同組小鼠腎臟組織切片圖（H.EX400);
[0023] 圖8為不同組小鼠胃組織切片圖（H.EX200);
[0024] 圖9為不同組小鼠腸組織切片圖（H.EX200);
[0025] 圖10為不同組小鼠心臟組織切片圖（H.EX200);
[0026] 圖11為不同處理組、不同飼養(yǎng)時間雞腸道內(nèi)沙門氏菌含量。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā) 明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0028] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等 均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常 規(guī)方法。
[0029] 本發(fā)明試驗(yàn)涉及的菌株：兩株鼠傷寒沙門氏菌（保藏號分別為ATCC14028和 ATCC13311)，甲型副傷寒沙門氏菌（保藏號為CMCC(B)50001)，腸炎沙門氏菌（保藏號 為CMCC50041)，傷寒沙門氏菌（保藏號為CMCC50071)和乙型傷寒沙門氏菌（保藏號為 CMCC50094)分別購于美國ATCC中心和中國普通微生物菌種保藏管理中心。
[0030] 本噬菌體STP4-a保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢、武漢大 學(xué)，保藏編號：CCTCCNO:M2014145,分類學(xué)命名：沙門氏菌噬菌體STP4-a(Salmonella bacteriophageSTP4_a)〇
[0031] 實(shí)施例1 :噬菌體分離制備及純化
[0032]將鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028接種至10mL營養(yǎng)肉湯中，過夜振蕩培養(yǎng)，得到宿主 菌液。次日取山東省青島市不同地點(diǎn)的污水樣品分別與宿主菌液混合培養(yǎng)后，離心（3318g， lOmin)取上清液經(jīng)過微孔濾膜（0. 22iim)除菌得到含有噬菌體的溶液，取該溶液0.lmL，進(jìn) 行10倍稀釋，取稀釋液各〇.lmL與過夜培養(yǎng)的宿主菌液0.lmL混勻，加入約5mL半固體培 養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入營養(yǎng)瓊脂平板上層，搖勻平置5min，待其凝固，置于37°C恒溫培養(yǎng) 箱培養(yǎng)12h后觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板，然后連續(xù)重復(fù)至少3次單斑穿刺進(jìn)行噬菌 體的純化，將純化后的噬菌體加入到宿主菌液中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，離心（7607g，20min)上清 液經(jīng)微孔濾膜（0.22iim)除菌后得到噬菌體原液。
[0033] 半固體培養(yǎng)基：由19g/L營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和33g/L營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按照1:1的體 積比配制而成。
[0034] 噬菌體電鏡觀察
[0035] 將噬菌體原液滴于石錯板上,將銅片網(wǎng)置于滴液中，15min后用濾紙吸去多余液 體，滴一滴磷鎢酸水溶液，染色lOmin后吸去多余液體，在空氣中干燥10-15min，在透射電 鏡下觀察噬菌體的形態(tài)。如圖1所示，噬菌體STP4-a為蝌蚪狀，頭部長度為lOOnm，橫徑為 80nm，具有長度約為120nm的細(xì)長尾部，屬于肌尾噬菌體科。
[0036] 實(shí)施例2溫度及pH對噬菌體的影響
[0037] 將含有900yL液體培養(yǎng)基的EP管放于不同溫度值的水浴中預(yù)熱60min，待溫度穩(wěn) 定后，加入100yL噬菌體原液，經(jīng)過60min培養(yǎng)后測定噬菌體效價；將900yL不同pH值的 液體培養(yǎng)基分別加入到2mL的EP管內(nèi)，置于溫度為37°C的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱30min，待溫 度穩(wěn)定后，加入100UL噬菌體原液，經(jīng)過60min培養(yǎng)后測定噬菌體效價。
[0038] 結(jié)果如圖2所示，40°C條件下噬菌體的活性在30min內(nèi)保持不變；在50°C條件下 15min和30min時仍分別有90%和75%的活性，但經(jīng)過60-80°C，15min處理后，噬菌體的活 性僅保留了不到0. 1%。30min處理后，噬菌體的存活數(shù)低于10pfu/mL。
[0039] 結(jié)果如圖3所示，STP4_a在pH為4-7的條件下，存活率為100%。pH為8-10時， 噬菌體的存活率仍有90%。pH為11和12時，噬菌體的存活率分別為70%和56%。
[0040] 實(shí)施例3噬菌體保存條件分析
[0041] 利用不同的方法保存噬菌體①將純化好的噬菌體溶液加入終濃度為20%的甘油 后保存在4°C和_20°C條件下。②將純化好的噬菌體溶液加入終濃度為30%的脫脂牛奶后 立即用液氮凍干，保存在_80°C條件下。分別保存一年后通過測定噬菌體的效價來判斷保存 方法的可行性。
[0042] 結(jié)果如圖4所示，-20°C低溫保存效果最好。4°C和-80°C低溫保存噬菌體1年后， 噬菌體的效價分別降低了近2個和1個數(shù)量級。
[0043] 實(shí)施例4噬菌體裂解譜分析
[0044] 將細(xì)菌接種到10mL液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，各取100 ii L菌液加入到5mL 半固體培養(yǎng)基中，傾倒至含有一層培養(yǎng)基的平板內(nèi)形成雙層平板，待干后，將10UL的102 至KTpfu/mL效價的噬菌體點(diǎn)滴至平板上，37°C倒置培養(yǎng)至噬菌斑出現(xiàn)。
[0045] 結(jié)果如表1所示，以宿主菌鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028為參照，STP4_a能夠同等 高效地裂解其余5株不同血清型的沙門氏菌，不同稀釋濃度的噬菌體溶液都在含沙門氏菌 的平板上形成了清晰透明度高的噬菌斑，顯示STP4-a對不同血清型的沙門氏菌有較強(qiáng)的 裂解效果。
[0046] 表1噬菌體裂解譜分析
[0047]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株寬裂解譜沙門氏菌噬菌體，其特征在于：保藏號為：CCTCC NO :M 2014145,該 噬菌體對沙門氏菌具有有效的裂解作用。
2. -種如權(quán)利要求1所述噬菌體在制備殺滅沙門氏菌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 將沙門氏菌噬菌體純化后，用于抑制和殺滅沙門氏菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：該噬菌體用于防止沙門氏菌污染和沙門 氏菌過度生長，其中所述的沙門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門 氏菌、傷寒沙門氏菌和乙型傷寒沙門氏菌。
4. 一種權(quán)利要求1所述的寬裂解譜沙門氏菌噬菌體在防治食品污染沙門氏菌方面的 應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：將噬菌體用水稀釋后，作為噴灑液或淋 洗液，用于對食品的生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)器具或生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行噴灑消殺，用于控制沙門氏菌對 所述的環(huán)境或器具或設(shè)備的污染。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述食品是指：由糧食、肉類、蔬菜、 蛋類中擇一的加工制品，或由它們組合的加工制品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株噬菌體及其抑菌應(yīng)用，尤其是一株寬裂解譜沙門氏菌噬菌體及其抑菌應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。一株寬裂解譜沙門氏菌噬菌體，保藏號為:CCTCC NO：M2014145，保藏日期為2014年4月24日，該噬菌體對沙門氏菌有強(qiáng)的裂解作用。在本發(fā)明中，該株噬菌體從電鏡形態(tài)上分析，屬于肌尾噬菌體科，將其命名為沙門氏菌噬菌體STP4-a；在40-60℃和pH為4-12的條件下都能夠存活；-20℃保存1年后活性穩(wěn)定；噬菌體保存的保護(hù)劑為含20%甘油的培養(yǎng)溶液。采用本發(fā)明的噬菌體特異性裂解沙門氏菌可以殺死具有耐藥性的沙門氏菌。CCTCC NO：M 201414520140424
【IPC分類】A61P31-04, C12N7-00, A01P1-00, A01N63-00, A23L3-3571, A61K35-76
【公開號】CN104830806
【申請?zhí)枴緾N201410508239
【發(fā)明人】王靜雪, 林洪, 李夢哲, 李萌
【申請人】中國海洋大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2014年9月28日