一種翻譯控制腫瘤蛋白的單克隆抗體雜交瘤及其單克隆抗體與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程領域，具體地涉及一種翻譯控制腫瘤蛋白的單克隆抗體雜交 瘤及其單克隆抗體與應用。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌（colorectalcancer,CRC)是西方國家最常見的實體瘤，約占惡性腫瘤 死亡率的10%。在美國結直腸癌居惡性腫瘤死因的第二位，每年大約有52, 000例結直腸癌 患者死亡。近年來，我國結直腸癌發(fā)病率也呈上升趨勢，居第五位惡性死因。肝臟是結直腸 癌最常見的遠處轉移器官，結直腸癌患者在疾病過程約有一半會進展為肝轉移，其中30% 的患者肝臟為惟一的轉移部位，15~35%的結直腸癌患者初診時發(fā)現(xiàn)同時性肝轉移，20~ 25%的患者隨后出現(xiàn)異時性肝轉移。肝轉移是結直腸癌常見死因，近一半以上患者會死于 肝轉移。結直腸癌肝轉移患者如果放棄治療則預后極差，中位生存時間為6~12個月，盡管 經過全身化療，但肝轉移瘤無法切除患者的中位生存時間只有12~24個月，生存時間超過 5年者罕見，結直腸癌同時性或異時性肝轉移一直是困擾臨床醫(yī)生的難題，如何盡早發(fā)現(xiàn)結 直腸癌肝轉移，或在結直腸癌根治術后對于肝轉移危險度進行評估，并指導術后治療是目 前面臨的重要挑戰(zhàn)。對結直腸癌術后肝轉移發(fā)生危險進行預測，有助于術后進行有針對性 的輔助治療，從而提尚整體生存率。
[0003] 結直腸癌肝轉移是一復雜而連續(xù)的過程，首先癌細胞從原發(fā)癌灶脫離，降解胞外 基質脫離原發(fā)灶進入門靜脈，隨后通過信號傳導，在相關受體和因子的作用下到達肝臟，穿 出血管重新粘附，進而在肝臟形成新生血管、再增殖，最終使肝轉移灶形成。在此過程中各 種粘附分子、血管新生因子、細胞外金屬基質蛋白酶等都產生作用。目前臨床上用以檢測結 直腸癌肝轉移灶的方法主要是通過B超、CT，MR和DSA等影像學手段，但對肝轉移灶的檢查 率僅為50~90%，而且對直徑lcm以下的微小轉移灶，很難做出明確的診斷，術中探查雖也 可發(fā)現(xiàn)一些早期結直腸癌肝轉移病灶，但當轉移病灶直徑小于4_時，探查發(fā)現(xiàn)率大為降 低。早期因臨床癥狀不典型，CEA，CA19-9等腫瘤標志物又缺乏特異性，診斷相對困難。無 論是結直腸癌初次確診時即己發(fā)現(xiàn)的肝轉移，抑或根治術后再發(fā)生的肝轉移，確診時僅有 1/4~1/3的肝轉移灶局限于一葉肝臟，大多數(shù)已經累及兩葉，并且為多發(fā)，難以手術切除。 因此，肝轉移癌的早期正確診斷對指導治療，改善預后非常重要。尋找有效且穩(wěn)定的早期診 斷結直腸癌肝轉移的生物學標志物，將對結直腸癌肝轉移的臨床診斷和治療產生深遠的 影響。
[0004] 翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)，又稱P21 (小鼠TCTP)、P23 (人TCTP)、Q23,是一類廣泛 存在于動物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族，人類TPT1基因 編碼的蛋白稱fortilin，是一類新的抗凋亡蛋白質。最初認為TCTP是一類生長相關蛋白， 近年的研宄提示TCTP具有非常重要的生物學功能，包括調節(jié)細胞周期的進程和惡性轉移、 鈣結合蛋白、細胞外組胺釋放蛋白、抗凋亡及抗瘧疾作用等。TCTP能夠增強細胞的轉移能 力，在結腸癌肝轉移病人血清中的含量顯著升高。檢測TCTP在血清中的表達量對于監(jiān)控結 直腸癌的轉移有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有結直腸癌肝轉移檢測技術所存在的不能 及時正確診斷的缺陷，提供一種分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株， 所述細胞株可分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述雜交瘤細胞株分泌的抗人翻譯控制腫瘤蛋白單 克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的應用。
[0008] 本發(fā)明的第四個目的是提供含有上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的免疫 檢測試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予實現(xiàn)的： 一種分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株MQ-ANTI-TCTP-1，其分 類命名為人翻譯控制腫瘤蛋白（Hu-TCTP)單克隆抗體雜交瘤細胞，所述細胞株于2014年 10月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9811，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0010] 上述雜交瘤細胞株的制備方法如下：取血清效價大于1 :104的BALB/c小鼠脾細 胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規(guī)方法用50%PEG-4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細胞，用重組表達的人翻譯控制腫瘤蛋白包被ELISA板進行 ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最后獲得穩(wěn)定分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白的雜交瘤細胞 株。
[0011] 由上述雜交瘤細胞株分泌獲得的抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體；優(yōu)選地，所 述單克隆抗體為IgGl型，輕鏈均為K鏈。
[0012] 所述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的制備方法：應用保藏編號為CGMCC No. 9811的雜交瘤細胞株以IX106/只的量注入石蠟預處理的8~10周齡的BALB/c雌性 小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察10~14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ProteinG SepharoseFastFlow純化單克隆抗體，并通過SepharoseS-200分子篩脫鹽，PBS洗脫，以 SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達到90%以上。
[0013] 上述任意一種抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑中的應用； 優(yōu)選地，所述腫瘤為結直腸癌。
[0014] 含有上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的免疫檢測試劑盒，所述免疫檢測試 劑盒還含有標記物，所述標記物為熒光標記物、放射性標記物或酶標記物。
[0015] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種能用于ELISA、化學發(fā)光、 western-blot、免疫熒光以及組織的免疫組織化學檢測的抗人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP) 單克隆抗體。
[0016] 本發(fā)明中人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 目前尚未有國產化的TCTP的抗體，國外有一些公司比如NovusBiologicals等有可以 檢測TCTP的抗體產品，盡管可以用于免疫組化、ELISA、Westernblot等實驗，但是抗體的 價格通常較昂貴，此外，像Abeam抗體以多抗居多，雖然特異性尚可，但是效價較低，另外一 些公司的抗體產品，與重組表達蛋白結合效果尚可，但是與天然TCTP蛋白反應效果不佳。 因此限制了該蛋白作為臨床靶標驗證及其功能的研宄進展。
[0018] 本發(fā)明以重組人翻譯控制腫瘤蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的 陽性，并用此純化抗體對結直癌細胞SW480和Lovo進行Western-blot證明該抗體可以識 別天然變性的人翻譯控制腫瘤蛋白。
[0019] 本發(fā)明將此純化抗體用于進行結直癌細胞Lovo的免疫熒光染色以及肝癌組織的 免疫組化染色證明其能識別天然的人翻譯控制腫瘤蛋白。此株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗 體為進一步研宄人人翻譯控制腫瘤蛋白的功能和開發(fā)人人翻譯控制腫瘤蛋白的臨床診斷 試劑奠定了基礎，為其作為腫瘤臨床診斷和治療靶標的驗證提供有力的工具。
[0020] 本發(fā)明的單克隆抗體其免疫原是原核重組表達人翻譯控制腫瘤蛋白全長蛋白，其 氨基酸序列為NP_003286. 1，全長172個氨基酸。與國外現(xiàn)有抗體相比，應用成本較低，能夠 適用于ELISA，Westernblot、等各種蛋白檢測實驗，本發(fā)明的抗體不僅能與變性蛋白結合， 還能與具有高級結構的天然蛋白結合，從而能應用于免疫熒光和免疫組化實驗。該抗體的 應用將為人翻譯控制腫瘤蛋白功能研宄和其作為結直腸癌腫瘤肝轉移標志物的臨床標本 驗證工作提供支持。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明單抗A1亞型鑒定結果。
[0022] 圖2是本發(fā)明單抗A1對結直癌細胞SW480和Lovo免疫印跡的結果以及陰性對照 結果，其結合條帶的分子量為23kDa附近。
[0023] 圖3是本發(fā)明單抗A1對結直癌細胞SW480和Lovo免疫熒光染色的結果以及普通 光鏡下的對照結果（顯微鏡放大倍數(shù)200倍）。
[0024] 圖4是本發(fā)明單抗A1對肝癌組織免疫組織化學染色的結果以及陰性對照結果 (顯微鏡放大倍數(shù)100倍）。
【具體實施方式】 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明的思 路，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的 本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改動都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。
[0026] 實施例1雜交瘤細胞株的制備 1、重組人翻譯控制腫瘤蛋白抗原制備：從結直腸癌細胞Lovo中調取TCTP基因構建 原核重組表達載體pET22b(+)/TCTP，在大腸桿菌EscherichiacoliBL21中表達，利用Ni S印harose親和層析純化柱進行純化，獲得純度達90%以上的重組人TCTP蛋白（TCTP蛋白 的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示）。
[0027] 其中，擴增人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)基因的引物序列為： 上游引物：5'-GTCGGATCCATGATTATCTACCGG-3'（SEQIDN0:2); 下游引物：5'-TTGCGGCCGCTTAACAmTTCCAITTCTAAACCA-3'（SEQIDN0:3); 其中，上游引入BamHI內切酶位點，下游引入NotI內切酶位點。
[0028] 2、小鼠免疫：取純化的TCTP重組蛋白與250y1Bentonite佐劑混合，以 100yg/500y1的量腹部皮下多點注射BALB/c小鼠，間隔三周以1100yg/500y1的量腹部 皮下多點注射BALB/c小鼠，從第三次免疫開始，每次免疫后的第二周尾靜脈采集小鼠血， 間接ELISA方法檢測血清效價達到1:50000以上后準備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強 免疫一次，抗原劑量100yg。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均使用商品化產品。
[0029] 3、免疫血清效價測定：采用間接ELISA法測定免疫血清效價。取30ygTCTP重組 蛋白溶解于l〇ml0. 05MpH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C過 夜。次日，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，用10mMPBS含10%新生牛血 清封閉液200y1/孔，37°C封閉lh，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，小鼠 于第三次免疫后15天尾靜脈采血，鼠免疫血清用含2 %新生牛血清10mMPBS以KL1~10 _8 倍稀釋，加入96孔板