[0054] 可以通過使用分類為EC1. 3. 8. 1的丁?；?CoA脫氫酶或者通過使用分類為EC 1. 3. 8. 7的中鏈?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化丙烯酰基-CoA來生產(chǎn)丙?；?CoA。
[0055] 可以通過使用去飽和酶/單加氧酶或細(xì)胞色素P450在（R) 3-羥基戊酸中形成第 一個乙烯基生產(chǎn)（R)3-羥基戊-4-烯酸丙烯?；?CoA?？梢酝ㄟ^使用分類為EC3. 1.2.-的 硫酯酶轉(zhuǎn)化（R)3-羥基戊?；?CoA來生產(chǎn)（R)3-羥基-戊酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC 1. 1. 1.36的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊酰基-CoA來生產(chǎn)（R) 3-羥基戊酰 基-CoA?？梢酝ㄟ^使用分類為EC2. 3. 1. 16的乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丙?；?CoA 來生廣3-氧代戊?；?CoA。
[0056] 可以通過使用?；?[acp]脫氫酶在戊-2-烯?；?acp中形成第一個乙烯基來生 產(chǎn)2, 4-戊二烯?；?[acp]?？梢酝ㄟ^（i)使用分類為EC4. 2. 1.-的5-羥基戊酰基-CoA 脫水酶在5-羥基戊?；?CoA中或（ii)使用分類為EC1. 3. 1. 34在2, 4-二烯酰基輔酶A 還原酶的戊-3-烯?；?CoA中形成第一個乙烯基來生產(chǎn)2, 4-戊二烯酰基-CoA。所述5-羥 基戊?；?CoA脫水酶可源自綠色梭菌（Clostridiumviride)。
[0057] 巴豆?；?CoA可以通過⑴使用分類為EC4. 1. 1. 70的戊烯二酰基-CoA脫羧酶 在戊烯二?；?CoA中，（ii)使用分類為EC4. 2. 1. 120的4-羥基丁?；?CoA脫水酶和分 類為EC5. 3. 3. 3的乙烯基乙酰基-CoA異構(gòu)酶在4-羥基丁基-CoA中或（iii)使用分類為 EC4. 2. 1. 119的烯?；?CoA水合酶在（R) 3-羥基丁酰基-CoA中形成第一個乙烯基來生 產(chǎn)。
[0058] 可以通過使用去飽和酶或單加氧酶在2-丁醇中形成第一個乙烯基來生產(chǎn)3-丁 稀-2_醇。
[0059] 第二個乙烯基通過甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MDD)在（R) 3-羥基戊-4-烯酸中酶促 形成。MDD可以是分類為EC4. 1. 1. 33的。MDD可以包含在催化裂隙的催化性精氨酸殘基 任一側(cè)的五個殘基中的最少四個絲氨酸殘基。MDD可以來自鏈球菌屬（Streptococcus)或 葡萄球菌屬（Staphylococcus)。
[0060] 第二個乙烯基可以通過異戊二烯合酶（ISPS)在2- 丁烯-1-醇二磷酸或3- 丁 烯-2-醇二磷酸中酶促形成。第二個乙烯基通過酶分類EC4.2. 1.-中的脫水酶在3-丁 烯-2-醇或2-丁烯-1-醇中酶促形成，所述脫水酶如芳樟醇脫水酶（EC4.2. 1. 127)、奇 維酮水合酶（EC4. 2. 1.95)、油酸水合酶（EC4. 2. 1.53)或類胡蘿卜素1，2_水合酶（EC 4. 2. 1. 131)。
[0061] 可以通過使用分類為EC4. 2. 1. 59的3-羥基?；?[acp]脫水酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基 戊?；?[acp]來生產(chǎn)戊-2-烯酰基-[acp]?？梢酝ㄟ^使用分類為EC1. 1. 1. 100的3-氧 代?；鵢[acp]還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊?；?[acp]來生產(chǎn)（R) 3-羥基戊?；?[acp]。
[0062] 可以使用分類為EC2. 3. 1. 41的|3 -酮?；? [acp]合酶I和?；D(zhuǎn)移酶如tcsA 轉(zhuǎn)化戊?；?CoA來生產(chǎn)3-氧代戊?；?[acp]。
[0063] 可以使用?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯?；?CoA來生產(chǎn)戊-2-烯?；?[acp]。可以 通過使用分類為EC4. 2. 1. 119的烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊酰基-CoA來生產(chǎn) 戊-2-烯?；?CoA?？梢酝ㄟ^使用分類為EC1.1. 1.36的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化 3-氧代戊?；?CoA來生廣（R) 3-羥基戊?；?CoA。
[0064] 可以通過使用分類為EC2. 3. 1. 16的乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丙?；?CoA 來生廣3-氧代戊?；?CoA。
[0065] 可以通過使用分類為EC5. 3. 3. 8的異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯?；?CoA來生產(chǎn) 戊-3_條醜基-CoA。
[0066] 可以（i)通過使用分類為EC2. 8. 3. 14的5-羥基戊酰基CoA-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化5-羥 基戊酸或（ii)使用細(xì)胞色素P450,如CYP153A6的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化戊?；?CoA來生產(chǎn)5-羥 基戊?；?CoA。可以使用5-羥基戊酸脫氫酶，如cpnD的基因產(chǎn)物或來自綠色梭菌的脫氫 酶轉(zhuǎn)化5-氧代戊酸來生產(chǎn)5-羥基戊酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC2. 6. 1. 48的5-氨基戊酸 轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化5-氨基戊酸來生產(chǎn)5-氧代戊酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC1. 21. 4. 1的D-脯氨 酸還原酶轉(zhuǎn)化D-脯氨酸來生產(chǎn)5-氨基戊酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC5. 1. 1. 4的脯氨酸消 旋酶轉(zhuǎn)化L-脯氨酸來生產(chǎn)D-脯氨酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC1. 5. 1. 2的吡咯啉-5-羧酸 還原酶轉(zhuǎn)化（S)-1-吡咯啉-5-羧酸來生產(chǎn)L-脯氨酸。可以通過L-谷氨酸5-半醛的自發(fā) 轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)（S)-l-吡咯啉-5-羧基。可以通過使用分類為EC1. 2. 1. 41的谷氨酸-5-半 醛脫氫酶轉(zhuǎn)化L-谷氨?；?5-磷酸來生產(chǎn)L-谷氨酸5-半醛?？梢酝ㄟ^使用分類為EC2. 7. 2. 11的谷氨酸5-激酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸來生產(chǎn)L-谷氨?；?5-磷酸。
[0067] 可以通過使用分類為EC1. 3. 1. 38的反式-2-烯?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯 ?；?CoA來生產(chǎn)戊?；?CoA。
[0068] 可以通過使用分類為EC4. 2. 1.-的脫水酶轉(zhuǎn)化2-羥基戊二?；?CoA來生產(chǎn)戊 烯二?；?CoA?？梢酝ㄟ^使用分類為EC2. 8. 3. 12的戊烯二酸CoA-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化2-羥基 戊二酸來生產(chǎn)2-羥基戊二?；?CoA?？梢酝ㄟ^使用分類為EC1.1. 99. 2的2-羥基戊二 酸脫氫酶轉(zhuǎn)化2-氧代戊二酸來生產(chǎn)2-羥基戊二酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC1.1. 1.36的 3-羥基丁?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化乙酰乙酰基-CoA來生產(chǎn)3-羥基丁?；?CoA?？梢酝ㄟ^使 用分類為EC2. 3. 1. 9的乙?；?CoAC-乙?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化乙?；?CoA來生產(chǎn)乙酰乙酰 基 _CoA〇
[0069] 可以通過使用CoA-轉(zhuǎn)移酶，如Ck_cat2的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化4-羥基丁酸來生產(chǎn)4-羥 基丁?；?CoA。可以通過使用分類為EC1. 1. 1. 61的4-羥基丁酸脫氫酶轉(zhuǎn)化琥珀酸半醛 來生產(chǎn)4-羥基丁酸，可以通過使用分類為EC1. 2. 1. 76的琥珀酸-半醛脫氫酶轉(zhuǎn)化琥珀酰 基-CoA來生產(chǎn)琥珀酸半醛。
[0070] 可以通過使用分類為EC1. 1. 1.B4的（R)-特異性仲醇脫氫酶轉(zhuǎn)化丁酮來生產(chǎn) 2_ 丁醇?？梢酝ㄟ^使用分類為EC4. 2. 1. 28的丙二醇脫水酶轉(zhuǎn)化2, 3 丁二醇來生產(chǎn)丁酮。 可以通過使用分類為EC1. 1. 1. 4的（R,R)- 丁二醇脫氫酶轉(zhuǎn)化（R)-乙偶姻（acetoin)來 生產(chǎn)2, 3 丁二醇?？梢酝ㄟ^使用分類為EC4. 1. 1. 5的乙酰乳酸脫羧酶轉(zhuǎn)化2-乙酰乳酸來 生產(chǎn)（R)-乙偶姻?？梢酝ㄟ^使用分類為EC2.2. 1.6的乙酰乳酸合酶轉(zhuǎn)化丙酮酸來生產(chǎn) 2-乙酰乳酸。可以通過使用分類為EC3. 1.2.-的硫酯酶轉(zhuǎn)化3-羥基戊-4-烯?；?CoA 來生產(chǎn)（R) 3-羥基戊-4-烯酸?？梢酝ㄟ^使用分類為EC4.2. 1的烯?；?CoA脫水酶轉(zhuǎn)化 2, 4-戊二稀?；?CoA來生廣3-羥基戊_4_稀酰基-CoA。可以使用2-羥基異己?；?CoA 脫水酶，如起始物（initiator)HadI和HadBC的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2-羥基戊-4-烯?；?CoA來 生產(chǎn)2, 4-戊二烯?；?CoA?？梢酝ㄟ^使用CoA-轉(zhuǎn)移酶，如GctAB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2-羥基 戊-4-烯酸來生產(chǎn)2-羥基戊-4-烯?；?CoA。可以通過使用（R)-2-羥基異己酸脫氫酶， 如來自艱難梭菌（Clostridiumdifficile)的LdhA的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2-氧代戊-4-稀酸生 廣2-羥基戊_4_稀酸。
[0071] 可以通過使用分類為EC3. 1.2.-的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R)3-羥基戊-4-烯酰基-CoA來 生產(chǎn)（R)-羥基戊-4-烯酸。可以通過使用分類為EC1.1. 1.36的乙酰乙?；?CoA還原酶 轉(zhuǎn)化3-氧代戊-4烯酰基-CoA來生產(chǎn)（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA?？梢酝ㄟ^使用分類 為EC2. 3. 1. 16的0 -酮硫解酶轉(zhuǎn)化丙烯?；?CoA來生產(chǎn)3-氧代戊-4-烯酰基-CoA?？?以通過使用分類為EC3. 1. 2.-的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R)3-羥基戊-4-烯酰基-CoA來生產(chǎn)（R)-羥 基戊-4-烯酸。可以通過使用（R) -3-羥基?；?ACP:C〇A轉(zhuǎn)酰基酶，如phaG的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化（R)-3-羥基戊-4-烯?；鵢[acp]來生產(chǎn)（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA?？梢酝ㄟ^使 用分類為EC4. 2. 1. 59的3-羥基?；?[酰基-運(yùn)載體-蛋白]脫水酶轉(zhuǎn)化2, 4戊二烯酰 基-[acp]來生產(chǎn)（R)-3-羥基戊-4-烯?；?[acp]?？梢酝ㄟ^使用分類為EC4.2.1.119 的烯?；?CoA脫水酶2轉(zhuǎn)化2, 4-戊二烯酰基-CoA來生產(chǎn)（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA。
[0072] 可以通過使用分類為EC2. 7. 4. 2的磷酸甲羥戊酸激酶或使用分類為EC 2. 7. 6.-的二磷酸激酶轉(zhuǎn)化2- 丁烯-1-醇磷酸來生產(chǎn)2- 丁烯-1-醇二磷酸?？梢酝ㄟ^使 用分類為EC2.7. 1.36的甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化2-丁烯-1-醇來生產(chǎn)2-丁烯-1-醇磷酸?？?以通過使用分類為EC1. 1. 1. 54的烯丙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化2-丁烯-1-醛來生產(chǎn)2-丁烯-1-醇。 可以通過使用分類為EC1. 2. 1. 48的長鏈乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化巴豆酸來生產(chǎn)2- 丁烯-1醛?？?以通過使用分類為EC6. 2. 1. 5的琥珀酸-CoA連接酶轉(zhuǎn)化巴豆?；?CoA來生產(chǎn)巴豆酸。
[0073] 可以通過使用分類為EC2. 7. 6.-的二磷酸激酶，如分類為EC2. 7. 6. 2的硫胺素 二磷酸激酶轉(zhuǎn)化2- 丁烯-1-醇來生產(chǎn)2- 丁烯-1-醇二磷酸。
[0074] 可以通過使用分類為EC2. 7. 6.-的二磷酸激酶轉(zhuǎn)化3-丁烯-2-醇或分類為EC 2. 7. 4. 2的磷酸甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇來生產(chǎn)3- 丁烯-2-醇二磷酸?？梢酝ㄟ^ 使用分類為EC2. 7. 1. 36的甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇來生產(chǎn)3- 丁烯-2-醇磷酸。
[0075] 在本申請所述的任何方法中，所述方法可以使用分離的酶、使用包含所述酶的細(xì) 胞裂解物或使用重組的宿主進(jìn)行。所述重組宿主可以是厭氧、微需氧或需氧培養(yǎng)的?？梢?將所述重組宿主細(xì)胞保持在陶瓷中空纖維膜中以便在發(fā)酵過程中保持較高的細(xì)胞密度。供 給所述發(fā)酵的主要碳源來源于生物或非生物原料。例如，所述生物原料是或者來源于單糖、 二糖、木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素如乙酰丙酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油三酯如甘油 和脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢棄物或城市垃圾。所述非生物原料是或者來源于天然氣、合成氣、C02/H2、 甲醇、乙醇、來自環(huán)己烷氧化工藝的非揮發(fā)性殘渣（NVR)或堿洗廢物流。
[0076] 宿主微生物可以是原核生物，所述原核生物來自埃希氏菌屬（Escherichia)如 大腸桿菌（Escherichiacoli);來自梭菌屬（Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridium kluyveri);來自棒狀桿菌（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum);來自貪銅菌（Cupriavidus)如鉤蟲貪銅菌（Cupriavidusnecator)或 耐金屬貪銅菌（Cupriavidusmetallidurans);來自假單胞菌（Pseudomonas)如焚 光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)或 Pseudomonasoleavorans;來自代爾夫特菌（Delftia)如代爾夫特食酸菌（Delftia acidovorans);來自芽抱桿菌（Bacillus)如枯草芽抱桿菌（Bacillussubtillis);來自 乳桿菌（Lactobacillus)如德氏乳酸桿菌（Lactobacillusdelbrueckii)或來自乳球菌 (Lactococcus)如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)。宿主微生物是真核生物，所述真核生 物來自曲霉（Aspergillus)如黑曲霉（Aspergillusniger);來自酵母菌（Saccharomyces) 如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae);來自畢赤酵母（Pichia)如畢赤酵母（Pichia pastoris);來自耶氏酵母（Yarrowia)如解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica);來自伊薩 酵母（Issatchenkia)如Issathenkiaorientalis;來自德巴利酵母屬（Debaryomyces)如 漢氏德巴利氏酵母G)ebaryomyceshansenii);來自Arxula如Arxulaadenoinivorans或 來自克魯維酵母（Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis)。
[0077] 在本申請所述的重組宿主中，可減弱催化丙酰基-CoA和乙?；?CoA水解的酶；可 減弱通過甲基檸檬酸循環(huán)消耗丙?；?CoA的酶；可減弱消耗丙?；?CoA形成丙酮酸的酶； 可減弱消耗丙?；?CoA形成丙二酸單?；?CoA的酶；可以將反饋抗性蘇氨酸脫氨酶經(jīng)基 因工程改造進(jìn)入宿主生物體中；可減弱催化乙?；?CoA縮合為乙酰乙?；?CoA的酮 硫解酶如AtoB或phaA的基因產(chǎn)物；可減弱在天然累積聚羥基脂肪酸酯的宿主菌株中聚合 物合酶；可減弱編碼磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅幕蛉鏿ta;減弱了編碼降解丙酸的乙酸激酶的基 因如ack;可減弱編碼將丙酮酸降解為乳酸的基因；減弱了編碼將磷酸烯醇式丙酮酸降解 為琥珀酸的基因如frdBC;可減弱編碼將乙酰基-CoA將解為乙醇的基因如adhE;可擴(kuò)增催 化補(bǔ)充檸檬酸循環(huán)中間體的添補(bǔ)反應(yīng)的酶；嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因如UdhA可以過表達(dá)；甘 油醛-3P-脫氫酶基因如GapN可以過表達(dá)；蘋果酸酶基因如maeA或maeB在所述宿主生物體 中可以過表達(dá)；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因如zwf在所述宿主生物體中可以過表達(dá)；果糖 1，6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主生物體中可以過表達(dá)；可以通過對細(xì)胞膜進(jìn)行遺傳工 程化結(jié)構(gòu)修飾增強(qiáng)或擴(kuò)增丁二烯穿過所述細(xì)胞膜向細(xì)胞外介質(zhì)的外流；或者可以通過基因 工程改造增加任意與丁二烯相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性來增強(qiáng)或擴(kuò)增丁二烯穿過所述細(xì)胞膜向細(xì)胞 外介質(zhì)的外流；在所述宿主生物體中減弱了將丁二烯降解為毒性中間體如1，2-環(huán)氧-3-丁 烯和1，2:3, 4-二環(huán)氧丁烷的加氧酶。
[0078] 在本申請所述的任何方法中，所述硫酯酶可以是tesB的基因產(chǎn)物；所述乙酰乙酰 基-CoA還原酶可以是phaB的基因產(chǎn)物；所述乙酰基-CoAC?；D(zhuǎn)移酶可以是BktB的基 因產(chǎn)物；所述烯?；?CoA水合酶可以是phaj的基因產(chǎn)物；所述去飽和酶可以是MdpJ的基 因產(chǎn)物；所述細(xì)胞色素P450可以是CYP4家族的基因產(chǎn)物；所述0 -酮?；鵢[acp]合酶I 是tcsB的基因產(chǎn)物；所述?；?轉(zhuǎn)移酶是tcsA的基因產(chǎn)物。
[0079] 本申請還提供了一種將丁烯醇轉(zhuǎn)化為丁二烯的方法。所述方法包括將3-丁 烯-2-醇與芳樟醇脫水酶接觸以便生產(chǎn)出1，3- 丁二烯。所述芳樟醇脫水酶的分類為EC 4. 2. 1. 127〇
[0080] 除非另有定義，本申請中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 對于發(fā)明所屬領(lǐng)域的通常理解具有相同的含義。盡管可以使用與本申請所描述的那些類 似或等價的方法和材料實(shí)施本發(fā)明，下文中描述了適宜的方法和材料。本申請中提及的所 有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)均通過引用整體并入本申請。在存在沖突的情況 下，以本申請的說明書包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為說明性的，其并非旨在 進(jìn)行限制。
[0081 ] 在下文中的附圖和說明書中對本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方式的細(xì)節(jié)進(jìn)行了闡述。 本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)從說明書和附圖以及從權(quán)利要求中將是顯而易見的。根據(jù) 專利法的標(biāo)準(zhǔn)慣例可以使用"基本上由……組成"或"由……組成"代替權(quán)利要求中的用詞 "包含"。
【附圖說明】
[0082] 圖1是由C4醛和酮、C4羥基-醛和二酮、丁烯、丁醛或不飽和的酮、丁醇、丁二醇、 C5烯醇和活化的丁醇生成1，3 丁二烯的主要酶活性的示意性總覽。
[0083] 圖2是使用2-氧代戊-4-烯酸作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0084] 圖3是使用丙烯酰基-CoA作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0085] 圖4是使用3-羥基-4-戊酸作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0086] 圖5是使用2, 4-戊二烯?；?[acp]作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意 圖。
[0087] 圖6是使用2, 4-戊二烯?；?CoA作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意 圖。
[0088] 圖7是使用巴豆?；?CoA作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0089] 圖8是使用3- 丁烯-2-醇作為中心前體生成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0090] 圖9是使用甲羥戊酸二磷酸脫羧酶合成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0091] 圖10是使用異戊二烯合酶合成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0092] 圖11是使用脫水酶合成丁二烯的生化通路的示意圖。
[0093] 圖12是MDD接受的替代底物的結(jié)構(gòu)：(a) 3-羥基-5-二磷酸戊酸和（b) 3-羥 基-3-甲基-丁酯。
[0094] 圖13是來自釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)(Uniprot(通用蛋白質(zhì)資源） 登記號P32377，SEQIDN0:1)、表皮葡萄球菌（Staphyloccocusepidermidis)(Uniprot登 記號Q7CCL9，SEQIDNO:2)和肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumonia)(Uniprot登記號 B8ZLF3，SEQIDN0:3)的MDD酶的氨基酸序列，在所述酶催化裂隙中的保守殘基加粗顯示。
[0095] 發(fā)明詳述
[0096] 特別地，本申請?zhí)峁┝嗣?、非天然的途徑、培養(yǎng)策略、原料、宿主微生物和對宿主生 化網(wǎng)絡(luò)的減弱，其在四碳和五碳鏈代謝產(chǎn)物中生成兩個末端乙烯基，以便由中心前體或中 心代謝產(chǎn)物合成1，3 丁二烯（在本申請中稱為"丁二烯"）。在本申請中使用的術(shù)語"中心 前體"用于指在合成丁二烯的通路中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。在本申請中使用的術(shù)語"中心代謝 產(chǎn)物"用于指在所有微生物中生產(chǎn)的用于支持生長的代謝產(chǎn)物。
[0097] 這樣，本申請中所述的宿主微生物可以包括能夠被操縱以使得能夠生產(chǎn)丁二烯的 內(nèi)源性途徑。在內(nèi)源性途徑中，所述宿主微生物天然地表達(dá)催化在所述途徑中的反應(yīng)的所 有酶。含有經(jīng)工程改造的途徑的宿主微生物不能天然地表達(dá)催化所述途徑中的反應(yīng)的所有 酶，但是其經(jīng)過工程改造，以使得在所述途徑中的所有酶在所述宿主中表達(dá)。在經(jīng)工程改造 的途徑中，所述酶可以來自單一的來源，即來自一個物種，或可以來自多個來源，即不同物 種。已從各種生物體中鑒定出編碼本申請所述的酶的核酸并且其易于從公開可用的數(shù)據(jù)庫 如GenBank或EMBL獲得。經(jīng)工程改造的宿主能夠天然地不表達(dá)或表達(dá)一些（例如，一種 或更多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或者六種或更多中） 本申請所述的通路的酶。還可以破壞經(jīng)工程改造的宿主的內(nèi)源性基因以阻止不利的代謝產(chǎn) 物的形成或者阻止在所述途徑中通過其他酶作用于此類中間體導(dǎo)致中間體的損失。經(jīng)工程 改造的宿主可以指重組的宿主或重組的宿主細(xì)胞。因此，根據(jù)下文中更加詳細(xì)的描述，如本 申請所述的重組的宿主可以包括編碼脫羧酶、脫氫酶、去飽和酶、單加氧酶、?；鵞?；\(yùn) 載體蛋白（acp)]脫氫酶、脫水酶或水合酶的一種或多種的核酸。
[0098] 此外，使用本申請所述的分離的酶，使用來自宿主微生物的裂解物（例如，細(xì)胞裂 解物）作為酶的來源或者使用來自不同宿主微生物的多種裂解物作為酶的來源可以在體 外進(jìn)行丁二醇的生產(chǎn)。
[0099] 圖1提供了可以由各種四碳或五碳分子包括C4醛和酮、C4羥基-醛和二酮、丁烯、 丁醛或不飽和的酮、丁醇、丁二醇、C5烯醇和活化的丁醇生產(chǎn)1，3 丁二烯的主要酶活性的概 述。
[0100] 4. 1在丁二烯的生物合成中生成第一個末端乙烯基的酶
[0101] 如圖2-8中所描述的，可以在4-草酰巴豆酸、2-羥基粘康酸半醛、2-羥基-6-氧 代壬_2, 4_二條_1，9-二醋、丙醜基-CoA、乳醜基-CoA、3_羥基丙醜基-CoA、（R) 3_輕 基-戊酸、戊-2-烯酰基-[acp]、5_羥基戊?；?CoA(通過5-羥基-戊-2-烯酰基-CoA)、 戊-3_條醜基-CoA、4_羥基丁醜基_CoA、戊條二醜基_CoA、（R) 3_羥基丁醜基_CoA或2_ 丁 醇中形成第一個乙烯基以生產(chǎn)此類化合物如2-氧代戊-4-烯酸、丙烯基-CoA、（R) 3-羥基 戊-4-烯酸、（R) 3-羥基戊-4-烯?；?[acp]、2, 4-戊二烯?；?CoA、巴豆?；?CoA和 3_ 丁條 _2_ 醇。
[0102] 在一些實(shí)施方式中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一個乙烯基是在4-草酰巴豆酸、2-羥基 粘康酸半醛或2-羥基-6-氧代壬-2, 4-二烯-1，9-二酯中通過4-草酰巴豆酸脫羧酶（EC 4. 1. 1. 77)、2-羥基粘康酸半醛水解酶（EC3. 7. 1. 9)或2-羥基-6-氧代壬-2, 4二烯二酯 水解酶（EC3. 7. 1. 14)酶促形成的以生產(chǎn)2-氧代戊-4-烯酸。參見例如圖2。
[0103] 在一些實(shí)施方式中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一個乙烯基是在丙?；鵢CoA、乳酰 基-CoA或3-羥基丙?；?CoA中通過丁?；?CoA脫氫酶（EC1. 3