皮細(xì)胞片層。
[0111]將生產(chǎn)實(shí)施例2和使用前述各膠原的情形的測試結(jié)果進(jìn)行了比較，并以4項(xiàng)進(jìn)行評價[1.凝膠強(qiáng)度；2.細(xì)胞粘附；3.細(xì)胞增殖；4.安全性]。結(jié)果，(A) {1.差；2.同等；3.差；4.良好}，(B) {1.良好(5.1 mg/ml) ;2.同等；3.差；4.良好}，(C) {1.差(I mg/ml)；2.差；3.未知；4.未知}，(D){1.同等(3 mg/ml)； 2.同等；3.差；4.未知}，(E){1.同等(3 mg/ml) ；2.差；3.未知；4.良好}，以及(F) {未被膠原酶溶解，因此不可用}。對于凝膠強(qiáng)度，需要一定水平的強(qiáng)度以使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞能夠生長。從這樣的角度來看，特別優(yōu)選的膠原種類和濃度是以上述濃度使用的生產(chǎn)實(shí)施例2的豬腱來源的酸溶性I型膠原Cellmatrix 1-A和(B)豬腱來源的I型膠原T-1002。當(dāng)基質(zhì)不具有一定水平的強(qiáng)度，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞不會生長，并且不能用于本發(fā)明。
[0112]參考實(shí)施例4.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(膠原暈)
以與生產(chǎn)實(shí)施例2相同的方式進(jìn)行，除了在生產(chǎn)實(shí)施例2使用253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生產(chǎn)細(xì)胞片層的步驟中，將要使用的膠原凝膠混合溶液的量從200 μ I變?yōu)?00 μ?或300 μ 1，生產(chǎn)細(xì)胞片層并切出，由此回收視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0113]與生產(chǎn)實(shí)施例2相比，當(dāng)膠原凝膠混合溶液的使用量為100 μ I時，由于少量膠原凝膠混合溶液所引起的表面張力的影響而在中央部分形成了薄的膠原凝膠層，以及隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，所接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞容易直接接觸底膜，這引起了操作切出片層期間視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的破損。當(dāng)膠原凝膠混合溶液的使用量為300 μ I時，由于膠原凝膠混合溶液的量較高，形成了厚的膠原凝膠層，這相對降低了能夠在小室中保留的培養(yǎng)基的量，以及因此，不容易進(jìn)行維持培養(yǎng)，膠原酶處理需要時間，并擔(dān)心細(xì)胞片層上的受損變大。
[0114]參考實(shí)施例5.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(膠原酶的暈和處理時間)
以與生產(chǎn)實(shí)施例2相同的方式進(jìn)行，除了在生產(chǎn)實(shí)施例2使用253Gl(iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生產(chǎn)細(xì)胞片層的步驟中，將I %膠原酶L (Nitta Gelatin)或I型膠原酶(Roche)與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層接觸，以10 μ I的量接觸10 min,以10 μ I的量接觸20 min,以10 μ I的量接觸30 min,以10 μ I的量接觸60 min,以20 μ I的量接觸20 min,以20μ I的量接觸60 min,以及以30 μ I的量接觸50 min,而不是以30 μ I的量接觸30 min,生產(chǎn)細(xì)胞片層并切出，由此回收視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0115]結(jié)果，當(dāng)膠原酶處理以10 μ I的量進(jìn)行60 min或20 μ I的量進(jìn)行60 min時，觀察到了與30 μ I進(jìn)行30 min相同水平的膠原降解。
[0116]參考實(shí)施例6.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(所接種的細(xì)胞數(shù))
以與生產(chǎn)實(shí)施例2相同的方式進(jìn)行，除了在實(shí)施例1使用253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生產(chǎn)細(xì)胞片層的步驟中，將小室中要接種的細(xì)胞數(shù)從5 X 15個細(xì)胞/500 μ I變?yōu)?A) 5 X 14個細(xì)胞/500 μ 1、(B) 1X 10 5/500 μ I 或(C) I X 106/500 μ 1，生產(chǎn)細(xì)胞片層并切出，由此回收視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0117]與生產(chǎn)實(shí)施例2相比，(A)和(B)由于少量的細(xì)胞而需要更長時間達(dá)到細(xì)胞匯合，并且(C)顯示了緩慢的生長且也往往需要更長的時間達(dá)到細(xì)胞匯合。
[0118]參考實(shí)施例7.視網(wǎng)膜色素i:皮細(xì)胞片層i:形成的基底膜
從生產(chǎn)自生產(chǎn)實(shí)施例2的253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)的細(xì)胞片層生產(chǎn)冰凍切片(冷凍切片)，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。緊密連接的形成通過ZO-1的表達(dá)確認(rèn)，以及基底膜的形成通過層粘連蛋白和IV型膠原的表達(dá)確認(rèn)。對于每種蛋白質(zhì)的檢測，使用了由Zymed制造的兔抗Z0-1 (1:100稀釋)、由Abcam制造的兔層粘連蛋白(1:200稀釋)、以及由Calb1chem制造的鼠抗人IV型膠原抗體(1:40)的相應(yīng)抗體。此外，從細(xì)胞核染色狀態(tài)確認(rèn)了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層具有單層上皮形式，該染色使用了由Molecular Probes制造的 4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI ；1 μ g/ml)。
[0119]視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的評價
評價1.細(xì)胞片層的視網(wǎng)膜色素上皮特異性基因表達(dá)譜
在生產(chǎn)實(shí)施例2中從59SV3、59SV9 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生產(chǎn)細(xì)胞片層的步驟中，在經(jīng)過I周、4周、2個月后，通過RT-PCR確認(rèn)構(gòu)成片層的細(xì)胞中BEST1、RPE65、MERTK,CRALBP的表達(dá)，其中在細(xì)胞匯合后當(dāng)培養(yǎng)基變?yōu)镾FRM-B27時的天為第O天。結(jié)果，觀察到了與陽性對照(人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞總RNA (由ScienCell制造，Cat N0.6545))相同水平的表達(dá)。這里，BESTl、RPE65、MERTK是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。CRALBP是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和米勒細(xì)胞(Muller cells)中表達(dá)的基因。
[0120]評價2.視網(wǎng)膜色素i:皮片層中殘留膠原的測暈
在膠原酶處理前和后，通過從生產(chǎn)自生產(chǎn)實(shí)施例2的253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)的各細(xì)胞片層切出而生產(chǎn)冰凍切片(冷凍切片)，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用Molecular Probes制造的4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(DAPI ；1 μ g/ml)染色細(xì)胞核，并用Calb1chem制造的兔抗人I型膠原抗體(1:40稀釋)染色I(xiàn)型膠原。結(jié)果，未從膠原酶處理后的片層中檢測到膠原，并證實(shí)膠原酶除去了包被在培養(yǎng)皿上的膠原。另一方面，從膠原酶處理前切出的片層中檢測到了膠原。
[0121]評價3.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的細(xì)胞因子分泌能力
在生產(chǎn)實(shí)施例2中從253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)和454E2 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)所生產(chǎn)的細(xì)胞片層切出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的步驟之前，回收transwell中頂面(Apical side)和底面(Basal side)上的培養(yǎng)基，并根據(jù) Arvydas M, 10VS.2006;47: 3612-3624中所描述的方法經(jīng)ELISA檢測VEGF和PEDF的生產(chǎn)量。結(jié)果，確認(rèn)了類似于Arvydas M, 10VS.2006; 47: 3612-3624中所報導(dǎo)的人類胚胎來源的視網(wǎng)膜色素上皮，VEGF主要在底面上分泌，并且PEDF主要在頂面上分泌(圖4)。表明了生產(chǎn)實(shí)施例2中從253G1和454E2所生產(chǎn)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層具有類似于活生物體中的細(xì)胞因子分泌能力，并且在功能上優(yōu)異。
[0122]評價4.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的跨上皮電阻
發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞層的屏障功能和阻抗即跨上皮/跨內(nèi)皮電阻(TER)之間的強(qiáng)相關(guān)性。在生產(chǎn)實(shí)施例2中從454E2 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)所生產(chǎn)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的切出步驟之前，根據(jù)MILLIP0RE描述的方法(使用Millicell ERS-2)將探針放置在小室內(nèi)部和外部的培養(yǎng)基中，并電測量TER。結(jié)果，TER為640 Ω ■ cm2，并顯示出類似于NatureProtocols voI 4，No 5 662-673 (2009)圖10中所報導(dǎo)的人胚胎來源的視網(wǎng)膜色素上皮的高TER值。表明了生產(chǎn)實(shí)施例2中所生產(chǎn)的本發(fā)明視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層具有類似于活生物體中的高屏障功能。
[0123]評價5.源自猴ES細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素i:皮細(xì)胞片層的移植
將生產(chǎn)實(shí)施例2中從從猴ES細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞CMK6所生產(chǎn)的猴視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層移植到猴的一只眼中，其根據(jù)Invest Ophthalmol Vis Sc1.1995年2月；36(2):381-90中所描述的方法進(jìn)行。在移植前，進(jìn)行視網(wǎng)膜光凝固以使待進(jìn)行移植的眼視網(wǎng)膜患病。在移植到猴的其中形成有視網(wǎng)膜光凝固黃斑的一只眼中起第28天，拍攝眼底照片，并通過使用OCT (光學(xué)相干斷層掃描)生成眼底斷層圖像為組織切片，在此基礎(chǔ)上確認(rèn)了視網(wǎng)膜的狀態(tài)。結(jié)果，通過熒光素血管造影術(shù)沒有發(fā)現(xiàn)熒光泄露，移植物存活，并且沒有發(fā)現(xiàn)諸如感官視網(wǎng)膜變薄等病狀。
[0124]評價6.源自猴iPS細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的移植
將生產(chǎn)實(shí)施例2中從從猴iPS細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞46a所生產(chǎn)的猴視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層移植到用于自體移植的一只眼的視網(wǎng)膜下，和移植到用于交叉移植的三只眼的視網(wǎng)膜下，其根據(jù)Invest Ophthalmol Vis Sc1.1995年2月;36 (2): 381-90中所描述的方法進(jìn)行。移植達(dá)一年后，拍攝眼底照片，并通過使用OCT (光學(xué)相干斷層掃描)生成眼底斷層圖像為組織切片，在此基礎(chǔ)上觀察了隨時間推移的視網(wǎng)膜狀態(tài)。在交叉移植中，發(fā)現(xiàn)了明顯的排斥反應(yīng)，諸如移植物外周的纖維性變化、通過熒光素血管造影術(shù)的熒光滲漏、以及通過OCT的視網(wǎng)膜下高亮度病變。另一方面，在自體移植中，沒有觀察到這樣明顯的排斥，通過熒光素血管造影術(shù)沒有發(fā)現(xiàn)熒光泄漏，移植物存活，并且未發(fā)現(xiàn)諸如感官視網(wǎng)膜變薄等病癥。
[0125]工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明，有可能容易并穩(wěn)定地生產(chǎn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的層壓片層，其具有構(gòu)成血管的細(xì)胞層，能夠補(bǔ)充活體中缺損的脈絡(luò)膜血管并在移植后供給氧氣和營養(yǎng)物給視網(wǎng)膜。本發(fā)明的細(xì)胞片層是非常有用的，因?yàn)樗谥不盥屎凸δ苄苑矫媸莾?yōu)異的，并且還可以治療嚴(yán)重的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，對此，簡單的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植并不能容易地提供充分的治療效果，諸如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，特別是與脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮相關(guān)的高度近視和嚴(yán)重葡萄膜炎等。
[0126]通過引用將本說明書中所引用的任何出版物包括專利和專利申請中所公開的內(nèi)容，都以其整體并入本文，達(dá)到它們已在本文中公開的程度。
[0127]本申請基于在日本提交的專利申請N0.2012-185932 (申請日:2012年8月24日)，其內(nèi)容全部并入本文。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.生產(chǎn)細(xì)胞片層的方法，所述細(xì)胞片層包含視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層，所述方法包含層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中層壓所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和血管形成細(xì)胞層，使得所述血管形成細(xì)胞層接觸所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的基底面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其中所述血管形成細(xì)胞層是由選自成血管細(xì)胞、血管上皮祖細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞的至少一種細(xì)胞所構(gòu)成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其中所述血管形成細(xì)胞層是由源自要用所述細(xì)胞片層移植的患者的組織或細(xì)胞、或者源自具有與所述患者HLA型匹配的HLA型的供體的細(xì)胞所構(gòu)成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層是通過包含以下步驟的方法所生產(chǎn)的細(xì)胞片層: (1)將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞接種并培養(yǎng)在膠原凝膠上以形成由所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層，以及 (2)用膠原酶降解所述膠原凝膠以分離由所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的所述細(xì)胞片層O
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是通過誘導(dǎo)ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化而獲得的。
7.通過根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的細(xì)胞片層。
8.用于移植的細(xì)胞片層，所述細(xì)胞片層包含通過用從體外到體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層、從所述細(xì)胞分泌的基底膜、以及血管形成細(xì)胞層。
【專利摘要】本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞片層的方法，該細(xì)胞片層包含視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層，該方法包含層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層的步驟，該血管形成細(xì)胞層由具有血管形成能力的血管構(gòu)成細(xì)胞或干細(xì)胞組成，并且提供了由該方法獲得的細(xì)胞片層。本發(fā)明還提供了用于移植的細(xì)胞片層，其包含用通過體外誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層、從這些細(xì)胞分泌的基底膜、以及由具有血管形成能力的血管構(gòu)成細(xì)胞或干細(xì)胞所構(gòu)成的血管形成細(xì)胞層。
【IPC分類】C12N5-071, C12N5-10, A61P27-02, A61K35-36, A61L27-00
【公開號】CN104755611
【申請?zhí)枴緾N201380051245
【發(fā)明人】高橋政代, 鐮尾浩行
【申請人】獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年8月23日
【公告號】CA2882802A1, EP2889374A1, US20150250828, WO2014030749A1