瞬時過表達(dá)編碼藥物轉(zhuǎn)運蛋白和/或藥物代謝酶的基因的可消耗的低溫保存的細(xì)胞的制作方法
【專利說明】瞬時過表達(dá)編碼藥物轉(zhuǎn)運蛋白和/或藥物代謝酶的基因的 可消耗的低溫保存的細(xì)胞 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及低溫保存的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞瞬時過表達(dá)一種或多種編碼藥物 轉(zhuǎn)運蛋白和/或藥物代謝酶的基因以使得所編碼的蛋白的活性在從低溫保存中解凍后的 所述細(xì)胞群體中是可檢測的。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 藥物開發(fā)是昂貴且耗時的嘗試，其中藥物候選物在獲得銷售其的監(jiān)管許可之前必 須滿足由政府部門例如美國食品和藥物管理局和歐洲藥品管理局制定的一定標(biāo)準(zhǔn)。重要 地，進(jìn)行了測定來篩選藥物候選物以確定是否某些是一種或多種藥物轉(zhuǎn)運蛋白和/或藥物 代謝酶的底物或抑制劑，因為其可對這樣的藥物的吸收、分布、代謝和消除、它們的毒性以 及藥物間相互作用具有顯著的作用。
[0004] 雖然穩(wěn)定表達(dá)編碼藥物轉(zhuǎn)運蛋白或藥物代謝酶的基因的細(xì)胞系可用于這樣的篩 選，但產(chǎn)生和維持其冷凍儲備物需要大量的時間和資源。并且，所表達(dá)的重組蛋白的水平通 常是可變的（實驗室與實驗室之間）并且可在這些細(xì)胞的傳代下隨時間過去而降低和/或 變得更加可變?？蛇x擇地，可將穩(wěn)定或瞬時表達(dá)編碼藥物轉(zhuǎn)運蛋白或藥物代謝酶的基因的、 新鮮平板接種的細(xì)胞用于這樣的篩選。然而，新鮮平板接種的細(xì)胞具有有限的幾天的保存 期限并且難以以維持其活力的方式進(jìn)行運送。此外，為了產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系，外來轉(zhuǎn)染的基因 實際上被整合至細(xì)胞的宿主基因組中并與宿主基因組在細(xì)胞分裂周期期間保持在一起。宿 主細(xì)胞中的染色體整合將導(dǎo)致宿主基因組的永久修飾，這潛在地導(dǎo)致其它基因的異常表達(dá) 從而引起宿主行為的非期望的改變和不可靠的實驗結(jié)果。因此，需要減少與藥物開發(fā)相關(guān) 的時間和資源投入并且提供可靠結(jié)果的、適合用于篩選藥物候選物的細(xì)胞。
[0005] 發(fā)明概述
[0006]本發(fā)明提供低溫保存的重組細(xì)胞，其適合用于篩選藥物候選物以確定是否某些是 一種或多種藥物轉(zhuǎn)運蛋白和/或藥物代謝酶的底物或抑制劑，其提供可靠的結(jié)果和現(xiàn)成 的方便性。期望地，低溫保存后的重組細(xì)胞群中的活性水平與新鮮轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的活性水 平是相當(dāng)?shù)摹４送?，容易將低溫保存的重組細(xì)胞裝入小瓶中并利用干冰或干式運輸（dry shipper)進(jìn)行運送，且在接收后方便地儲存在-135°C液氮中，具有數(shù)年的保存期限。因此， 這樣的細(xì)胞為最終用戶提供了可消耗的"解凍和使用"產(chǎn)品，其提供進(jìn)行實驗的便利并減少 產(chǎn)生和/或維持用于篩選藥物候選物的細(xì)胞儲備物的時間和資源的投入。
[0007]在一個方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種瞬時過表達(dá)基因的低溫保存的重組細(xì) 胞，所述基因編碼選自藥物轉(zhuǎn)運蛋白和藥物代謝酶或其組合的蛋白，其中所述藥物轉(zhuǎn)運蛋 白或藥物代謝酶或組合的活性在從低溫保存中解凍后的所述低溫保存的重組細(xì)胞群體中 是可檢測的。
[0008]在另一個方面，本發(fā)明提供了制備瞬時轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞的方法，所述重組細(xì)胞瞬 時過表達(dá)一種或多種編碼選自藥物轉(zhuǎn)運蛋白和藥物代謝酶或其組合的蛋白的基因，所述方 法包括用一種或多種編碼藥物轉(zhuǎn)運蛋白或藥物代謝酶的基因瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞和在轉(zhuǎn)染的48 小時內(nèi)低溫保存瞬時轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的這些和其它特征將通過研宄下文的詳細(xì)描述而被更好地理解。
[0010] 附圖概述
[0011] 圖1是針對懸浮生長的FreeStyle?293-F(FS293)細(xì)胞和293-F細(xì)胞的來自細(xì)胞 儲備物、電穿孔（EP)后的細(xì)胞和從低溫保存中解凍后的細(xì)胞的活細(xì)胞百分比圖。
[0012] 圖2是從低溫保存中解凍后的平板接種之后4小時（A)、24小時⑶和48hrs (C)， 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的圖像。
[0013] 圖3是以（A)0.4x 106個活細(xì)胞/孔和（B)0.2x 106個活細(xì)胞/孔，平板接種于24 孔聚-D-賴氨酸涂覆的平板中并在平板接種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、用pOATPIBl表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 293-F細(xì)胞在平板接種（從低溫保存中解凍后）后24小時的圖像。
[0014] 圖4是以0. 4x 106個活細(xì)胞/孔平板接種于24孔聚-D-賴氨酸涂覆的平板中的， 用MATE1、MATE2K 0ATP1B3、長同種型0AT1 (具有563個氨基酸的全長cDNA ;在本文中被稱 作"長0AT1"）、短同種型0AT1 (缺失C-末端522-534上的13個氨基酸，具有550個氨基 酸；在本文中被稱作"短0AT1")、0AT3和pCMV載體轉(zhuǎn)染的293-F細(xì)胞在平板接種（從低溫 保存中解凍后）后24小時的圖像。
[0015] 圖5是用50μg/ml、100μg/ml或200 μg/ml綠色熒光蛋白（GFP)轉(zhuǎn)染的貼壁 HEK293細(xì)胞在EP后24小時（A)和48小時⑶的熒光圖像。
[0016] 圖6是使用不同量DNA對貼壁HEK293細(xì)胞進(jìn)行EP后的活細(xì)胞百分比圖。
[0017]圖 7A 是在 EP 后 48 小時，用不同量的 DNA (即 0、50 y g/ml、100 y g/ml、200 y g/ml 或400 y g/ml的0ATP2/0ATP1B1)轉(zhuǎn)染的貼壁HEK293細(xì)胞中，在不同的溫育時間后的雌二 醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收活性的圖。
[0018]圖 7B 是在 EP 后 96 小時，用不同量的 DNA (即 0、50 y g/ml、100 y g/ml、200 y g/ml 或400 y g/ml的0ATP2/0ATP1B1)轉(zhuǎn)染的貼壁HEK293細(xì)胞中，在不同的溫育時間后的雌二 醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收活性的圖。
[0019]圖 8 是在 EP 后 48 小時，用不同量的 DNA(即 0、50y g/ml、100y g/ml、200 y g/ml 或400 y g/ml的0ATP2/0ATP1B1)轉(zhuǎn)染的貼壁HEK293細(xì)胞中，在不同的溫育時間后的雌二 醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收的信噪比圖。
[0020]圖9是使用小規(guī)模EP設(shè)備（0C400)用0ATP2/0ATP1B1、使用大規(guī)模EP設(shè)備（CL2) 用0ATP2/0ATP1B1或用空載體對照轉(zhuǎn)染的貼壁HEK293細(xì)胞中，雌二醇-17 0 -葡糖苷酸 (E17 0G)吸收活性的圖。
[0021] 圖10是使用"對照"（即傳統(tǒng)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamine 2000,可獲自 Invitrogen))或STX、MaxCyte可擴展EP設(shè)備用0ATP1B1基因轉(zhuǎn)染的貼壁HEK293細(xì)胞中， 在不同的溫育時間后的雌二醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收的信噪比的圖。
[0022] 圖11是用0ATP1B1轉(zhuǎn)染的貼壁HEK293細(xì)胞中，在不同的溫育時間后的雌二 醇-170-葡糖苷酸（E170G)吸收的信噪比的圖，其中所述細(xì)胞是新鮮平板接種的或是從 低溫保存中解凍后平板接種的。
[0023] 圖12是使用MaxCyte可擴展EP設(shè)備和按比例放大過程用0ATPlBl*la(基因登錄 號 NM_006446. 4)、0ATPlBl*lb (基因登錄號 NM_006446. 3)、0ATP1B3、pCMV 載體、長同種型 0AT1 (具有563個氨基酸的全長cDNA)、0AT3、0CT1或0CT2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞在低溫保存、 解凍、平板接種于聚-D-賴氨酸平板上和在平板接種后溫育24小時后的圖像。
[0024] 圖13A是描述在用3yM濃度的PAH溫育不同的時間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)0AT1或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中p-氨基馬尿酸鹽（PAH) (0AT1的原型底物） 吸收的時間依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0025] 圖13B是描述其中測量在溫育5分鐘后，過表達(dá)0AT1的HEK293細(xì)胞對濃度為3 至200yM的PAH的吸收的動力學(xué)測定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計算的Km和Vmax在 圖中顯示為插注。
[0026] 圖13C是描述其中使用15 y M濃度的PAH和0-300 y M濃度的丙磺舒（0AT1抑制 劑）溫育過表達(dá)0AT1的HEK293細(xì)胞5分鐘的抑制測定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計 算的IC50在圖中顯示為插注。
[0027] 圖14A是描述在用lyM濃度的E3S溫育不同的時間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)0AT3或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中雌酮-3-硫酸鹽（E3S) (0AT3的原型底物） 吸收的時間依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0028] 圖14B是描述其中測量在溫育1分鐘后，過表達(dá)0AT3的HEK293細(xì)胞對濃度為0. 5 至32yM的E3S的吸收的動力學(xué)測定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計算的Km和Vmax在 圖中顯示為插注。
[0029] 圖14C是描述其中使用4 y M濃度的E3S和0-300 y M濃度的丙磺舒（0AT3抑制 劑）溫育過表達(dá)0AT3的HEK293細(xì)胞5分鐘的抑制測定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計 算的IC50在圖中顯示為插注。
[0030] 圖15A是描述在用31yM濃度的TEA溫育不同的時間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)0CT1或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中TEA(0CT1的原型底物）吸收的時間依賴性 測定的結(jié)果的圖。
[0031] 圖15B是描述在用3. 8yM濃度的甲福明溫育不同的時間（即1、2、5、10和15分 鐘）后，過表達(dá)0CT1或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中甲福明（0CT1的原型底物）吸收的時間 依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0032] 圖15C是描述其中測量在溫育10分鐘后，過表達(dá)0CT1或pCMV載體的HEK293細(xì) 胞對濃度為1、10和100 yM的TEA的吸收的濃度依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0033] 圖15D是描述其中測量在溫育10分鐘后，過表達(dá)0CT1或pCMV載體的HEK293細(xì) 胞對濃度為〇. 1、1和10 yM的甲福明的吸收的濃度依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0034] 圖15E是描述其中使用TEA和不同濃度（0. 1-500 yM)的0CT1抑制劑（奎那定、 異搏定或decynium-22)溫育過表達(dá)0CT1的HEK293細(xì)胞10分鐘的抑制測定的結(jié)果的圖。
[0035] 圖15F是描述其中使用3.8yM濃度的甲福明和不同濃度（4yM-3mM)的0CT1抑 制劑西咪替丁溫育過表達(dá)0CT1的HEK293細(xì)胞10分鐘的抑制測定的結(jié)果的圖。
[0036] 圖16A是描述在用31yM濃度的TEA溫育不同的時間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)0CT2或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中TEA(0CT2的原型底物）吸收的時間依賴性 測定的結(jié)果的圖。
[0037] 圖16B是描述在用3. 8yM濃度的甲福明溫育不同的時間（即1、2、5、10和15分 鐘）后，過表達(dá)0CT2或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中甲福明（0CT2的原型底物）吸收的時間 依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0038] 圖16C是描述其中測量在溫育10分鐘后，過表達(dá)0CT2或pCMV載體的HEK293細(xì) 胞對濃度為1、10和100 yM的TEA的吸收的濃度依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0039] 圖16D是描述其中測量在溫育10分鐘后，過表達(dá)0CT2或pCMV載體的HEK293細(xì) 胞對濃度為〇. 1、1和10 yM的甲福明的吸收的濃度依賴性測定的結(jié)果的圖。
[0040] 圖16E是描述其中使用3. 8 y M濃度的甲福明和4 y M-3mM濃度的0CT2抑制劑西 咪替丁溫育過表達(dá)0CT2的HEK293細(xì)胞10分鐘的抑制測定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot 計算