用于生產(chǎn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其包含層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和在移植后構(gòu)成血管的細(xì)胞層。本發(fā)明還涉及用于移植的細(xì)胞片層，其包含從視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層、基底膜以及在移植后構(gòu)成血管的細(xì)胞層。
【背景技術(shù)】
[0002]通過(guò)移植細(xì)胞片層形式的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞而治療視網(wǎng)膜變性疾病的方法，該細(xì)胞片層形式接近體內(nèi)形式。例如，正在實(shí)施自體組織移植(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)1-3)，包括將從年齡相關(guān)性黃斑變性患者的視網(wǎng)膜組織切除的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞片層(作為脈絡(luò)膜伴隨層)移植到受損黃斑區(qū)。源自患者組織的細(xì)胞片層是有問(wèn)題的，這是因?yàn)槌艘浦彩中g(shù)之外，還產(chǎn)生了由于患者視網(wǎng)膜上的切除手術(shù)所導(dǎo)致的侵入風(fēng)險(xiǎn)，并發(fā)癥的發(fā)病率高，移植后黃斑功能的改善和穩(wěn)定保持的有效率低，等等。
[0003]作為利用從體外到體內(nèi)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，無(wú)需依賴(lài)于采集患者視網(wǎng)膜，使用通過(guò)在人工膜或羊膜上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞而獲得的用于移植的細(xì)胞片層，以便掩蓋很脆弱的單層上皮的剛度不足，這種方法是已知的。然而，人工膜是不適合移植的，因?yàn)樗诮M成、性質(zhì)、剛度等方面不同于通過(guò)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞本身體內(nèi)產(chǎn)生的基底膜，并且容易引起與其相關(guān)的炎癥和排斥。與此相關(guān)，本發(fā)明人報(bào)導(dǎo)了容易形成由從體外到體內(nèi)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和細(xì)胞本身所產(chǎn)生的基底膜所構(gòu)成的細(xì)胞片層的方法(例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)I等)。由于通過(guò)該方法獲得的細(xì)胞片層具有由活體類(lèi)似的那些組分構(gòu)成的基底膜，因此它很容易植入、具有剛性、在處理性方面優(yōu)異并優(yōu)選用于移植治療。
[0004]視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞病有時(shí)會(huì)發(fā)展出脈絡(luò)膜纖維化和萎縮作為并發(fā)癥，以及脈絡(luò)膜微血管的不足，并顯示出無(wú)法供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物給視網(wǎng)膜色素上皮和視覺(jué)細(xì)胞。具有基底膜的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層在這些癥狀中的移植帶來(lái)一個(gè)問(wèn)題，即所希望的治療效果由于缺乏脈絡(luò)膜微血管而難以實(shí)現(xiàn)，其妨礙了移植后對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞充足的營(yíng)養(yǎng)物和氧供應(yīng)以及所移植的細(xì)胞體內(nèi)功能的充分展示。
[0005]另一方面，作為利用血管再生的治療方法，包括移植內(nèi)皮祖細(xì)胞、形成體內(nèi)血管并治療視網(wǎng)膜疾病的方法是已知的。例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)2報(bào)導(dǎo)了注射到玻璃體中的骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞定位于視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞中，并入到血管中以形成正常的視網(wǎng)膜血管。然而，通過(guò)專(zhuān)利文獻(xiàn)2的方法，經(jīng)利用星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的定位而再生了視網(wǎng)膜血管，但是不可能形成脈絡(luò)膜血管來(lái)保護(hù)分開(kāi)定位的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視覺(jué)細(xì)胞。
[0006][文獻(xiàn)列表]
[專(zhuān)利文獻(xiàn)]
專(zhuān)利文獻(xiàn) 1:W02011/142364 專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 JP-A-2005-538742 [非專(zhuān)利文獻(xiàn)]
非專(zhuān)利文獻(xiàn) I:Am J Ophthalmol.2012 年 I 月;153 (I): 120-7 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2:Acta Ophthalmol.2011 年 9 月;89(6):e490_5 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3:Br J Ophthalmol.2011 年 3 月;95(3):370_5。
[0007]發(fā)明概述
發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的問(wèn)題是研發(fā)方便且穩(wěn)定地不使用人工膜來(lái)生產(chǎn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的新方法，從而提供用于移植的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層，其顯示出高植活率以及功能性方面的優(yōu)異，即使是對(duì)于患有諸如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，特別是高度近視、嚴(yán)重葡萄膜炎等與脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮相關(guān)疾病的患者。
[0008]解決問(wèn)題的手段
本發(fā)明人已進(jìn)行了深入的研宄，并研發(fā)出了細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其包含層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和在移植后具有形成血管的能力的細(xì)胞。他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)這樣的方法所獲得的細(xì)胞片層同時(shí)包含視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層兩者，并且因此，當(dāng)移植給患者時(shí)，它不僅重建了視網(wǎng)膜組織，而且通過(guò)血管形成重建了脈絡(luò)膜，以及對(duì)于治療脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，特別是與脈絡(luò)膜病相關(guān)的視網(wǎng)膜變性疾病是有用的。此外，當(dāng)通過(guò)在膠原凝膠層上鋪板視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞并將其培養(yǎng)而制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層時(shí)，所獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層保持了膠原凝膠和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層之間的基底膜，具有細(xì)胞因子分泌能力和類(lèi)似于體內(nèi)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的那些的細(xì)胞之間的粘附性，該視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層可以很容易地通過(guò)用膠原酶分解膠原凝膠而與細(xì)胞培養(yǎng)基材分開(kāi)，同時(shí)保留基底膜。另外，構(gòu)成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的細(xì)胞保持了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。基于這些發(fā)現(xiàn)，他們已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的研宄，并完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容:
[I]生產(chǎn)細(xì)胞片層的方法，所述細(xì)胞片層包含視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層，所述方法包含層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層的步驟。
[0009][2] [I]的生產(chǎn)方法，其中層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層，使得血管形成細(xì)胞層接觸視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的基底面。
[0010][3] [I]或[2]的生產(chǎn)方法，其中血管形成細(xì)胞層是由選自由成血管細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的組的至少一種細(xì)胞所構(gòu)成的。
[0011][4] [I]或[2]的生產(chǎn)方法，其中血管形成細(xì)胞層是由源自要用該細(xì)胞片層移植的患者的組織或細(xì)胞、或者源自具有與該患者HLA型匹配的HLA型的供體的細(xì)胞所構(gòu)成的。
[0012][5] [1]-[4]任一項(xiàng)的生產(chǎn)方法，其中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層是通過(guò)包含以下步驟的方法所生產(chǎn)的細(xì)胞片層:
(1)將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞接種并培養(yǎng)在膠原凝膠上以形成由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層，以及
(2)用膠原酶降解膠原凝膠以分離由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層。
[0013][6] [1]_[5]任一項(xiàng)的生產(chǎn)方法，其中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是通過(guò)誘導(dǎo)ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化而獲得的。
[0014][7] [1]-[6]任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的細(xì)胞片層。
[0015][8]用于移植的細(xì)胞片層，所述細(xì)胞片層包含用通過(guò)從體外到體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層、從所述細(xì)胞分泌的基底膜、以及血管形成細(xì)胞層。
[0016]發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，有可能容易且穩(wěn)定地生產(chǎn)層壓的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層，其具有能夠補(bǔ)充活體中所缺乏的脈絡(luò)膜血管并在移植后給視網(wǎng)膜供應(yīng)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物的血管構(gòu)成細(xì)胞層。本發(fā)明的細(xì)胞片層是非常有用的，因?yàn)樗谥不盥屎凸δ苄苑矫媸莾?yōu)異的，并且還可以治療嚴(yán)重的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，對(duì)此，簡(jiǎn)單的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植并不能容易地提供充分的治療效果，諸如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，特別是高度近視和嚴(yán)重葡萄膜炎等，它們與脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮相關(guān)。
[0017]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1顯示了移植有本發(fā)明的細(xì)胞片層的宿主組織切片的免疫組織化學(xué)染色。
[0018]圖2顯示了(A)顯示出通過(guò)每種培養(yǎng)基中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞所形成的血管數(shù)量的曲線圖，以及(B)顯示通過(guò)使用基質(zhì)膠的每種培養(yǎng)基中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞所形成的血管數(shù)量的曲線圖。
[0019]圖3顯示了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的細(xì)胞因子分泌能力的測(cè)試結(jié)果。
[0020]實(shí)施方案描述
對(duì)本發(fā)明如下進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0021]本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞片層的方法，所述細(xì)胞片層包含視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層，所述方法包含層壓視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和血管形成細(xì)胞層的步驟(本發(fā)明的生產(chǎn)方法)。
[0022]1.血管形成細(xì)胞層
本發(fā)明中的血管形成細(xì)胞層是由具有血管形成能力的細(xì)胞(血管形成細(xì)胞)所構(gòu)成的。當(dāng)將通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法獲得的細(xì)胞片層移植到視網(wǎng)膜變性患者的脈絡(luò)膜中的缺損部位時(shí)，細(xì)胞片層中所包含的血管形成細(xì)胞會(huì)在移植部位重建血管(優(yōu)選脈絡(luò)膜血管)，其供應(yīng)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物給視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。因此，通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法所獲得的細(xì)胞片層可以展現(xiàn)優(yōu)異的治療效果，通過(guò)移植到特別是患有與脈絡(luò)膜缺損相關(guān)的視網(wǎng)膜變性疾病的患者的脈絡(luò)膜缺損部位中。
[0023]盡管本發(fā)明的血管形成細(xì)胞可以是源自任何哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，只要它是源自哺乳動(dòng)物(例如，人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠等)，但它優(yōu)選源自人的細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明中要使用的血管形成細(xì)胞的例子包括成血管細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。在這些細(xì)胞中，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞等作為血管形成細(xì)胞是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些細(xì)胞被認(rèn)為在移植后的體內(nèi)血管形成過(guò)程中能夠容易地并入已有血液血管網(wǎng)中。血管形成細(xì)胞層可以包含除血管形成細(xì)胞外的細(xì)胞以及除了細(xì)胞外的組分，以及可以由包含血管形成細(xì)胞的細(xì)胞群或組織所構(gòu)成。通常，構(gòu)成血管形成細(xì)胞層的的細(xì)胞不少于70% (優(yōu)選不少于80 %，更優(yōu)選不少于90 %，最優(yōu)選100 % )是血管形成細(xì)胞(優(yōu)選血管內(nèi)皮祖細(xì)胞)。
[0025]血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是指具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力和致力于分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞。已報(bào)導(dǎo)過(guò)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物的多種表達(dá)模式，且已知基于細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)模式的至少統(tǒng)一的定義是困難的。過(guò)去報(bào)導(dǎo)過(guò)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)模式的例子包括用于外周血單核細(xì)胞來(lái)源的CD34陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD34+、CD44+、VEGFR2+ (KDR) (Science.1997 年 2 月 14 日;275 (5302):964-7);用于臍帶血單核細(xì)胞來(lái)源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的 CD31+、VEGFR2+、eNOs+、CD105+、CD34+/' CD133\ CD45' CD14'⑶117_ (人內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(ECFCs (注冊(cè)商標(biāo))，由Takara B1制造))；等等。盡管它們被認(rèn)為是由于所源自組織的差異、分化階段、采集方法等，但它們是有共性的，因?yàn)樗鼈內(nèi)烤哂蟹只裳軆?nèi)皮細(xì)胞的能力。如本文所使用的，因此，將血管內(nèi)皮祖細(xì)胞定義為“具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力和致力于分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞”，并且細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)模式耐受多種組合的存在。
[0026]眾所周知，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞包含在卵黃囊、外周血、骨髓、臍帶血、它們的單核細(xì)胞等中，并且可以從這些組織或細(xì)胞通過(guò)已知分離方法進(jìn)行制備。分離方法的例子包括使用細(xì)胞表面標(biāo)志物諸如⑶34、VEGF受體2(KDR)等的表達(dá)作為指標(biāo)以及使用磁珠和FACS的分離方法；利用市售內(nèi)皮細(xì)胞集落形成單位(CFU-ECS)(N Engl J Med.2003; 348: 593-600)的方法等。作為外周血單核細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞來(lái)源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的生產(chǎn)方法的具體例子，以下方法是已知的，包括通過(guò)常規(guī)使用的方法在包含細(xì)胞因子諸如VEGF等的血管內(nèi)皮促分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離自外周血或骨髓的單核細(xì)胞、并作為粘附細(xì)胞而回收血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法；作為CD34陽(yáng)性細(xì)胞而從外周血分離和回收血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，其已通過(guò)使用 G-CSF 從骨髓募集(Yakugaku Zasshi 2007 125(5) 841-845 等)，等等。
[0027]另外，可以誘導(dǎo)各種細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。例如，通過(guò)去分化從成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法；從多能干細(xì)胞諸如ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等誘導(dǎo)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化(W02008/056779,WO 2009/035217等)等方法是已知的。這些血管內(nèi)皮祖細(xì)胞可以單獨(dú)使用或者可以組合使用其多種。作為本發(fā)明的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，可以使用包含其他細(xì)胞的細(xì)胞混合物。例如，包含血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的骨髓細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞等也可直接使用。
[0028]可以通過(guò)諸如以下方法的已知方法來(lái)制備血管內(nèi)皮細(xì)胞，包括通過(guò)使用細(xì)胞表面標(biāo)志物諸如⑶31等的表達(dá)作為指標(biāo)并使用磁珠和FACS而從活體血管組織分離細(xì)胞的方法；通過(guò)在誘導(dǎo)物諸如VEGF等存在下培養(yǎng)上述血管內(nèi)皮祖細(xì)胞而誘導(dǎo)分化的方法，等等。另外，也可以誘導(dǎo)各種細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且已知，例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化可以從成體干細(xì)胞諸如間質(zhì)干細(xì)胞、源自干細(xì)胞的脂肪組織等；祖細(xì)胞諸如心肌祖細(xì)胞、神經(jīng)元前體細(xì)胞等；多能干細(xì)胞諸如ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等誘導(dǎo)；等等。此外，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的市售產(chǎn)品，人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)、人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC、HA0EC)等是可以獲得的。
[0029]成血管細(xì)胞是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的共同祖先細(xì)胞，并且可以通過(guò)使用細(xì)胞表面標(biāo)志物諸如⑶133、⑶144、⑶45等的表達(dá)作為指標(biāo)而從活體血管組織制備，通過(guò)已知方法諸如使用磁珠和FACS等的分離方法。作為成血管細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)模式，例如，已報(bào)導(dǎo)了 D133+、CD144+、CD45+、CD34+、VEGFR2+、CD3r的組合(Stem CellsDev.2004 年 6 月;13 ⑶:229-42.)。
[0030]作為本發(fā)明中要使用的血管形成細(xì)胞，可以使用源自要用由本發(fā)明生產(chǎn)方法所獲得的細(xì)胞片層移植的患者組織或細(xì)胞，或者源自具有與該患者HLA型相匹配的HLA