的接觸面上表達的標(biāo)志物是目標(biāo)。
[0064]本說明書中的基底膜標(biāo)志物包括在基底膜中特異性表達的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物或降解產(chǎn)物。這樣的基因的例子包括層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(perlecan)、巢蛋白、IV型膠原等。其中，層粘連蛋白、IV型膠原等是優(yōu)選使用的，它們是基底膜的主要組分。
[0065]用于“確認已分離的細胞片層和膠原凝膠之間的接觸面上基底膜的存在與否”的樣品沒有特別限制，只要它包含源自步驟(2)所分離的細胞片層(或細胞)的基底膜標(biāo)志物(例如，RNA、蛋白質(zhì)、其降解產(chǎn)物等)。
[0066]當(dāng)上述樣品是RNA時，基底膜標(biāo)志基因表達的檢查可以通過從步驟(2)分離的細胞片層的細胞制備RNA (例如，總RNA、mRNA)級分、并檢測級分中所包含的標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或者直接檢測細胞中的標(biāo)志基因產(chǎn)物而不從細胞中提取RNA。
[0067]當(dāng)從細胞制備RNA(例如，總RNA、mRNA)級分時，它可以使用已知方法諸如胍-CsCl超離心法、AGPC法等進行制備。使用市售的RNA提取試劑盒(例如，RNeasy Mini Kit;由QIAGEN等制造)，可以迅速且方便地從痕量樣品制備高純度的總RNA。檢測RNA級分中基底膜標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法的例子包括使用雜交(Northern印跡、斑點印跡、DNA芯片分析等)的方法，使用PCR (RT-PCR、競爭性PCR、實時PCR等)的方法等。定量PCR方法諸如競爭性PCR、實時PCR等是優(yōu)選的，因為基底膜標(biāo)志基因的表達變化可以從痕量樣品迅速且方便地檢測到，并且DNA芯片分析是優(yōu)選的，因為多個標(biāo)志基因的表達變化可以全部檢測到，并且還可以通過選擇檢測方法來改善定量性能，等等。
[0068]當(dāng)采用Northern印跡或斑點雜交時，基底膜標(biāo)志基因可以使用能與該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的核酸(探針)進行檢測。這樣的核酸的例子包括能在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與基底膜標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的核酸。“高嚴(yán)謹(jǐn)條件”的例子包括在45°C下于6XSSCX氯化鈉/檸檬酸鈉)中的雜交反應(yīng)，接著在65°C下于0.2XSSC/0.1% SDS中洗滌一次或多次，等等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過適當(dāng)改變雜交溶液的鹽濃度、雜交反應(yīng)的溫度、探針濃度、探針長度、錯配數(shù)、雜交反應(yīng)時間、洗滌的鹽濃度、洗滌溫度等而容易地調(diào)節(jié)到所希望的嚴(yán)謹(jǐn)度。核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA嵌合體，優(yōu)選DNA。
[0069]要作為探針使用的核酸可以是雙鏈的或單鏈的。當(dāng)為雙鏈時，它可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或者DNA = RNA雜合體。當(dāng)為單鏈時，可以使用反義鏈。盡管核酸的長度沒有特別限制，只要它能夠與靶核酸特異性雜交，它是例如不少于約15個堿基，優(yōu)選不少于約30個堿基。為了靶核酸能夠檢測和定量，要用作探針的核酸優(yōu)選進行標(biāo)記。標(biāo)記試劑的例子包括放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素的例子包括[32P]、[3H]、[14C]等。作為酶，具有高比活性的穩(wěn)定酶是優(yōu)選的，例如，β半乳糖苷酶、葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。熒光物質(zhì)的例子包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等。發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。而且，生物素-(鏈霉)抗生物素蛋白也可用于結(jié)合探針和標(biāo)志物。
[0070]當(dāng)采用Northern雜交時，將如上所述制備的RNA級分通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素、尼龍、聚偏二氟乙烯等的膜上，在上述“高嚴(yán)謹(jǐn)條件”下于包含如上所述制備的標(biāo)記探針的雜交緩沖液中雜交，并通過合適方法測量每個條帶結(jié)合到膜上的標(biāo)志物的量，由此可以測量每個基底膜標(biāo)志基因的表達水平。并且在斑點印跡的情況下，將用RNA級分點過的膜進行類似的雜交反應(yīng)(對每個標(biāo)志基因都進行)，并測量斑點處的標(biāo)志物的量，由此可以測量每個標(biāo)志基因的表達水平。
[0071]當(dāng)采用DNA芯片分析時，例如，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引入合適啟動子諸如T7啟動子等的cDNA是從如上所述制備的RNA級分合成的，cRNA是使用RNA聚合酶(在這種情況下，標(biāo)記的cRNA是通過使用標(biāo)記有生物素等作為底物的單核苷酸而獲得的)合成的。將標(biāo)記的cRNA與其上固定有上述探針的芯片相接觸以進行雜交反應(yīng)，并測量固相上與每個探針結(jié)合的標(biāo)志物的量，由此可以測量每個基底膜標(biāo)志基因的表達水平。這種方法就快速性和便利性而言是有利的，因為所檢測的分化標(biāo)志基因的數(shù)量(因此，被固相化的探針)增加了。
[0072]另一方面，當(dāng)不從細胞中提取RNA而檢測標(biāo)志基因時，原位雜交可以用作檢測手段。在該方法中，通過用固定劑處理細胞將細胞固定，固定劑優(yōu)選沉淀固定劑例如丙酮，或者通過在緩沖甲醛溶液中短時間孵育細胞，而不從細胞中提取RNA。imrecruitment后，將細胞包埋在石蠟中以形成塊，并且由此切出的切片可以用作樣品。良好制備的石蠟包埋的樣品可以在室溫下保存很多年。作為要用作探針的核酸，可以使用類似于上述例子的那些。原位雜交在本發(fā)明中是優(yōu)選使用的，因為能夠直接確認細胞和膠原凝膠之間的接觸面上的基底膜標(biāo)志物的表達。
[0073]可選地，步驟(2)的已分離細胞片層中基底膜標(biāo)志物的表達可以通過制備來自細胞片層(或細胞)的蛋白質(zhì)級分、并檢測級分中所包含的標(biāo)志基因的翻譯產(chǎn)物(即，標(biāo)志蛋白)進行確認，或者直接檢測細胞片層(或細胞)中的標(biāo)志基因的翻譯產(chǎn)物、而不從細胞片層(或細胞)中提取蛋白質(zhì)。標(biāo)志蛋白可以通過免疫學(xué)測量方法(例如，ELISA、FIA、RIA、Western印跡等)使用每種蛋白質(zhì)的抗體進行檢測，以及在顯示可測量的生理活性的蛋白質(zhì)諸如酶等的情況下，它可以通過已知方法測量各標(biāo)志蛋白的生理活性進行檢測?？蛇x地，標(biāo)志蛋白還可以通過質(zhì)譜法諸如MALD1-T0FMS等進行檢測。
[0074]每種標(biāo)志蛋白的抗體可以根據(jù)通常使用的多克隆抗體或單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)、并使用標(biāo)志蛋白或蛋白質(zhì)或其部分肽作為免疫抗原來獲得。
[0075]當(dāng)各免疫學(xué)測量方法分別應(yīng)用于本發(fā)明時，特殊條件、操作等的設(shè)定是不必要的?；啄?biāo)志蛋白的測量系統(tǒng)可以通過在每種方法的一般條件和操作方法中加入本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的一般技術(shù)考慮進行構(gòu)建。對于這些一般技術(shù)手段的細節(jié)，可以參考綜述(compendia)、書籍等。例如，可以參考 Hiroshi Irie 主編的 “Rad1immunoassay”(Kodansha, 1974 年出版)，Hiroshi Irie 主編的 “cont.Rad1immunoassay” (Kodansha,1979 年出版)，Eiji Ishikawa 等主編的“Enzyme Immunoassay”( Igaku-Shoin, 1978 年出版)，Eiji Ishikawa 等主編的“Enzyme Immunoassay”(第 2 版)(Igaku-Shoin, 1982 年出版)，Eiji Ishikawa 等主編的“Enzyme Immunoassay”(第 3 版)(Igaku-Shoin, 1987 年出版)，“Methods in ENZYM0L0GY”第 70 卷(Immunochemical Techniques(A 部)、同上第 73 卷(Immunochemical TechniquesCB 部))、同上第 74 卷(Immunochemical Techniques(C 部))、同上第 84 卷(Immunochemical Techniques(D 部:Selected Immunoassays))、同上第 92 卷(Immunochemical Techniques (E:Monoclonal Antibodies and General ImmunoassayMethods))、同上第 121 卷(Immunochemical Techniques( I 部:Hybridoma Technology andMonoclonal Antibodies))(都由 Academic Press 出版)等等。
[0076]血管形成細胞層可以直接層壓在前述視網(wǎng)膜色素上皮細胞層上，或者血管形成細胞層可以經(jīng)由其他層進行層壓。在本發(fā)明中，視網(wǎng)膜色素上皮細胞層和血管形成細胞層優(yōu)選直接層壓。
[0077]本發(fā)明還涉及包含視網(wǎng)膜色素上皮細胞層和血管形成細胞層的細胞片層，其通過本發(fā)明的上述生產(chǎn)方法獲得。本發(fā)明的細胞片層優(yōu)選包含由通過干細胞或祖細胞的從體外到體內(nèi)分化誘導(dǎo)而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細胞所形成的細胞層以及血管形成細胞層。當(dāng)視網(wǎng)膜色素上皮細胞層通過上述膠原方法生產(chǎn)時，本發(fā)明的細胞片層進一步包含從視網(wǎng)膜色素上皮細胞層所分泌的基底膜。本發(fā)明的細胞片層優(yōu)選作為用于眼科疾病患者的視網(wǎng)膜治療的移植材料。眼科疾病的例子包括脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病諸如年齡相關(guān)性黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、脈絡(luò)膜萎縮、視網(wǎng)膜色素上皮脫離、葡萄膜炎(Behcet病、Harada病等)、過度近視(病理性近視)等。
[0078]由于本發(fā)明的細胞片層包含血管形成細胞層，因此它可以對同時涉及病性脈絡(luò)膜的疾病以高植活率進行移植。因此，通過本發(fā)明生產(chǎn)方法獲得的細胞片層優(yōu)選用于治療上述作為例子的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性疾病，其中特別是與脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮相關(guān)的眼科疾病，對于它們，視網(wǎng)膜色素上皮細胞的排他移植不易提供治療效果(年齡相關(guān)性黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜萎縮、視網(wǎng)膜色素上皮脫離、葡萄膜炎(Behcet病、Harada病等)以及過度近視(病理性近視)等)。
[0079]另外，由于本發(fā)明的細胞片層具有從類似于活生物體的那些組分制備的基底膜，因此它也可以用于各種篩選目的，諸如前述眼科疾病中的療效篩選、毒性評價等。對于前述眼科疾病的療效篩選，例如，可以將本發(fā)明的細胞片層應(yīng)用于篩選對前述眼科疾病具有效果的物質(zhì)，根據(jù)JP-A-2007-500509中所描述的方法進行。具體而言，本發(fā)明的細胞片層在候選物質(zhì)存在或不存在下進行培養(yǎng)，所述候選物質(zhì)在可能引起前述眼科疾病的應(yīng)激條件下(例如，光(例如，白光、藍光；誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細胞特別是感光細胞死亡的光)，并且可以是黃斑變性激發(fā)因子)，A2E [類視色素(retinoid) N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺](A2E的累積被認為促成了視網(wǎng)膜細胞的年齡相關(guān)性神經(jīng)變性，特別是黃斑變性的表達)，香煙煙霧聚集物(吸煙被認為是黃斑變性的危險因素)，外部壓力(例如，流體靜力壓；眼內(nèi)壓的增加被懷疑與青光眼有關(guān)))具有效果，并且可以基于表達視紫紅質(zhì)的光感受器的數(shù)量并通過使用抗半胱天冬酶3 (caspase 3)抗體的免疫染色進行評價。對于毒性評價，本發(fā)明的細胞片層可根據(jù)JP-A-2007-517210中所描述的方法應(yīng)用于篩選毒性物質(zhì)。具體而言，本發(fā)明的細胞片層在毒性候選物質(zhì)存在或不存在下進行培養(yǎng)，并使用JP-A-2007-517210中所描述的整聯(lián)蛋白標(biāo)志肽，在488 nm波長下用激光激發(fā)，并檢測520 nm下的熒光進行評價。而且，本發(fā)明的細胞片層還可以用作體外模型，用于評價視網(wǎng)膜色素上皮細胞的各種體內(nèi)功能，諸如與視覺細胞維持相關(guān)的功能諸如光感受器外節(jié)的吞噬能力、神經(jīng)保護作用等，視網(wǎng)膜血管屏障功能諸如泵送作用、緊密連接等。
[0080]本發(fā)明用于移植的細胞片層可以用于人類和除人之外的哺乳動物(例如，猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉鼠、豚鼠等)中上述疾病的治療。
[0081]本發(fā)明用于移植的細胞片層可以應(yīng)用的疾病面積的范圍是根據(jù)施用對象的目標(biāo)疾病、動物種類、年齡、性別、體重以及癥狀等等而適當(dāng)確定的。
[0082]本發(fā)明用于移植的細胞片層可以一次性或者分幾部分進行移植。移植的應(yīng)用次數(shù)是由衛(wèi)生保健專業(yè)人員根據(jù)疾病和準(zhǔn)則進行確定的。例如，當(dāng)疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性疾病時，本發(fā)明用于移植的細胞片層可以視其嚴(yán)重性進行兩次或更多次移植。當(dāng)移植進行多次時，間隔時間沒有特別限制，并且可以安排數(shù)天至數(shù)周的期間。
[0083]本發(fā)明用于移植的細胞片層是由衛(wèi)生保健專業(yè)人員根據(jù)符合準(zhǔn)則的適當(dāng)移植方法進行移植的。當(dāng)本發(fā)明用于移植的細胞片層在視網(wǎng)膜下移植時，可以采用的移植方法包括:將片層在來自穿刺注射針的水流上進行遞送，直到眼球視網(wǎng)膜下的移植部位，或者也可以使用專用于移植的治療裝置。
實施例
[0084]通過參考實施例對本發(fā)明進行如下更詳細的解釋，實施例僅為示例，且不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0085]生產(chǎn)實施例1。視網(wǎng)膜色素上皮細胞的制備
作為要在下面的生產(chǎn)實施例2中使用的視網(wǎng)膜色素上皮細胞，所使用的是通過誘導(dǎo)人iPS細胞的分化而獲得的成熟視網(wǎng)膜色素上皮細胞(253G1、K11PD2、59M8、59SV2、59SV3、59SV9、46a、K21EV15、101EV3、K11EV9、454E2)，以及通過誘導(dǎo)ES細胞的分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細胞(hES、CMK6)，根據(jù) Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 中所描述的方法進行。
[0086]<人iPS來源的視網(wǎng)膜色素上皮細胞>
253G1是通過源自健康人的人iPS