構(gòu)成的細(xì)胞片層。
[0045]盡管要在步驟(I)中接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以是源自任何哺乳動物的細(xì)胞，只要它源自哺乳動物(例如，人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉鼠、豚鼠等)，優(yōu)選源自人的細(xì)胞。
[0046]在膠原方法中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是通過接種在膠原凝膠上進(jìn)行培養(yǎng)的。用于膠原凝膠的膠原可以是任何膠原，只要它源自哺乳動物(例如，人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉鼠、豚鼠等)，以及例如，使用人或豬來源的膠原。源自膠原的組織的例子包括腱、皮膚等。盡管膠原種類可以是任何種類，構(gòu)成人基底膜的膠原之外的一種是優(yōu)選的，IV型膠原之外的一種是特別優(yōu)選的。在這些膠原中，I型膠原是優(yōu)選使用的。盡管膠原凝膠可以通過例如常規(guī)已知的生產(chǎn)方法進(jìn)行生產(chǎn)，在本發(fā)明中，由膠原纖維網(wǎng)所構(gòu)成的凝膠是通過誘導(dǎo)膠原的纖維發(fā)生進(jìn)行生產(chǎn)的，如在下述實施例中所描述的。由于纖維化膠原具有組合的強度和柔韌性，其易于處理，顯示出細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的良好維持，以及優(yōu)選作為本發(fā)明中要使用的膠原凝膠。另外，要在本發(fā)明中使用的膠原需要將接種在膠原凝膠上的細(xì)胞維持在凝膠表面而不使它們沉入凝膠層。作為膠原，因此，優(yōu)選的是其中凝膠具有細(xì)胞增殖所需強度的膠原，以及例如，具有大量分子間交聯(lián)的膠原是優(yōu)選的。作為這樣的膠原，可以提及源自腱的膠原。
[0047]盡管前述膠原凝膠的膠原濃度可以在任何范圍，只要它能提供的凝膠具有允許視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞植入和生長的強度、以及令人滿意的促進(jìn)膠原酶降解的溶解性、使得易于操作的粘度等等，但是優(yōu)選0.1% (W/V) -0.5% (W/V)，更優(yōu)選0.2% (W/V) -0.3% (W/V)。當(dāng)膠原凝膠的膠原濃度低于0.1% (W/V)時，膠原凝膠的強度變得不足，并且因此，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的定殖率和細(xì)胞增殖率都會降低。當(dāng)膠原凝膠的膠原濃度超過0.5% (W/V)時，膠原酶處理降解膠原凝膠的時間變長，這恐怕會對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。
[0048]盡管用于生產(chǎn)前述膠原凝膠的膠原凝膠混合溶液的體積隨細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)面積和培養(yǎng)基材形狀而變化，但是優(yōu)選約100 μ 1-約250 μ 1，更優(yōu)選約150 μ 1_約200μ 1，每單位面積(cm2)。當(dāng)膠原凝膠混合溶液的量太小時，由于施加到凝膠表面的表面張力的影響而形成了具有薄的中心部分的膠原凝膠層，并且片層在由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞片層切除期間易于受損，這是由于當(dāng)培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞時，細(xì)胞直接與培養(yǎng)基材接觸。當(dāng)膠原凝膠混合溶液的量過量時，會在培養(yǎng)基材上形成厚的膠原凝膠層，這相對降低了培養(yǎng)基的量，以及因此，維持培養(yǎng)不易進(jìn)行，膠原酶處理要花時間，并且要擔(dān)心由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞片層上的損傷。
[0049]在步驟(I)中，由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞片層可通過在細(xì)胞培養(yǎng)基材的膠原凝膠上接種并培養(yǎng)前述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)基材沒有特別限制，只要它是用于細(xì)胞培養(yǎng)的。其例子包括具有多孔膜的培養(yǎng)容器諸如transwell等、燒瓶、組織培養(yǎng)瓶、平皿、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、多皿、微量培養(yǎng)板、微孔板、多板、多孔板、腔室玻片、培養(yǎng)皿、管、托盤、培養(yǎng)袋和轉(zhuǎn)瓶。具有多孔膜的培養(yǎng)容器是優(yōu)選的，因為方便進(jìn)行膠原酶處理和細(xì)胞片層的切割操作。例如，市售的transwell是優(yōu)選使用的。本說明書中的細(xì)胞培養(yǎng)基材材料的例子包括，但不限于，無機材料諸如金屬、玻璃、陶瓷、硅等，由彈性體、塑料(例如，聚酯樹脂、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂、尼龍、丙烯酸樹脂、氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚氨酯樹脂、甲基戊烯樹脂、酚醛樹脂、三聚氰胺樹脂、環(huán)氧樹脂、氯乙烯樹脂)所代表的有機材料。
[0050]要接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的數(shù)量可以是任何范圍，只要它是能夠形成細(xì)胞片層的細(xì)胞密度。然而，當(dāng)細(xì)胞密度太低時，細(xì)胞形狀不好，達(dá)到匯合之前的培養(yǎng)時間長，以及進(jìn)一步地，細(xì)胞成熟并著色所需的時間長。當(dāng)細(xì)胞密度太高時，類似地，細(xì)胞增殖被抑制，達(dá)到匯合之前的培養(yǎng)時間往往變長，并且細(xì)胞可能死于過于擁擠。因此，要接種細(xì)胞的密度優(yōu)選為約4.5X 14個細(xì)胞/cm2-約8.5X 15個細(xì)胞/cm2，更優(yōu)選約8.5X 14個細(xì)胞/cm2_約8.5X 15個細(xì)胞/cm2，最優(yōu)選約4.5X 15個細(xì)胞/cm2。
[0051]由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成的單層細(xì)胞群(細(xì)胞片層)可以通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)接種在膠原凝膠上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞而形成?？梢允褂玫呐囵B(yǎng)基沒有特別限制，只要它是通常用于相關(guān)領(lǐng)域中的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基。例如，描述于Asakura Shoten出版的“Japan tissue culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rd edit1n，，第581頁的基本培養(yǎng)基都是可以使用的，諸如F-1O培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、MEM、BME培養(yǎng)基、DMEM、α MEM、IMD培養(yǎng)基、ES培養(yǎng)基、DM-160培養(yǎng)基、Fisher培養(yǎng)基、WE培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基等。而且，血清(胎牛血清等)、各種生長因子(EGF、FGF、HGF、H)GF等)、抗生素、氨基酸等都可以添加到基本培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的PH優(yōu)選為約6-約8。對于培養(yǎng)而言，例如，原代培養(yǎng)通常在約30-約40°C進(jìn)行約15-約60 hr，直至視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成匯合。此后，進(jìn)行繼代培養(yǎng)約I周-約2個月，同時改變培養(yǎng)基，在此之后，必要時同時通氣并攪拌而進(jìn)行培養(yǎng)，直至細(xì)胞片層的形成。將構(gòu)成由這樣的培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞片層的細(xì)胞維持為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。細(xì)胞作為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的維持可以通過檢測作為特異性分化標(biāo)志物的 BESTl、RPE65、MERTK、CRALBP 等來確認(rèn)。
[0052]由于步驟(I)中形成的細(xì)胞片層粘附于膠原凝膠，例如，當(dāng)它被直接用于移植等的時候，就會擔(dān)心膠原凝膠妨礙在移植受體中的植活。另外，令人擔(dān)心的是膠原凝膠可能妨礙血管形成細(xì)胞層和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層的結(jié)合和粘附。如果可以預(yù)先除去膠原凝膠，這有助于解決這樣的問題。在本發(fā)明的步驟(2)中，將粘附于步驟(I)中所形成細(xì)胞片層的膠原凝膠通過膠原酶降解。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)用于制備膠原凝膠的膠原種類選擇適當(dāng)?shù)哪z原酶。盡管用于降解膠原凝膠的膠原酶沒有特別限制，只要它具有消化膠原凝膠的活性，但不易降解構(gòu)成人基底膜的膠原的膠原酶(例如，IV型膠原等)是優(yōu)選的。例如，可以使用源自從梭菌(溶組織梭菌(Clostridium histolyticum))或鏈霉菌(微細(xì)鏈霉菌(Streptomycesparvulus))所誘導(dǎo)的微生物的膠原酶，它們是在商業(yè)水平供應(yīng)的、安全的并具有尚酶活性。
[0053]作為上述膠原酶活性，相對于膠原凝膠中的膠原重量的比活性是重要的，而不是每單位重量膠原酶的活性和每單位體積膠原酶水溶液的活性。用于溶解膠原凝膠的膠原酶比活性(膠原酶活性/膠原重量)優(yōu)選不低于0.1 U/mgo當(dāng)膠原酶的比活性低于0.1 U/mg時，膠原凝膠的溶解可能要不利地花太長時間，或者凝膠可能不利地未充分溶解。更優(yōu)選的是 0.1-10，000 U/mg 的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選 1-3，000 U/mgo
[0054]在膠原方法中，讓膠原酶作用于膠原凝膠的方法沒有特別限制。使用培養(yǎng)基或具有緩沖能力的等滲溶液作為溶劑而制備的膠原酶溶液可以添加到培養(yǎng)基中，或者從細(xì)胞培養(yǎng)皿分離的粘附有細(xì)胞的膠原凝膠可以浸入前述膠原酶溶液中。由于transwell用作本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)基材，膠原凝膠層可以通過回收小室(insert)并除去小室底部上的膜而暴露，并且暴露的膠原凝膠優(yōu)選直接浸入上述膠原酶溶液中。
[0055]在膠原方法中，通過膠原酶溶解膠原凝膠的時間沒有特別限制。當(dāng)膠原酶起作用的時間太長時，細(xì)胞功能諸如粘附能力、增殖能力等可能不利地降低。盡管經(jīng)膠原酶溶解的時間會由于膠原酶比活性、溫度、膠原凝膠形狀、膠原酶處理方法等而發(fā)生變化，但其通常為15 min-60 min。膠原酶處理可以是單次處理或進(jìn)行多次。
[0056]膠原方法中經(jīng)膠原酶處理膠原凝膠期間的溫度優(yōu)選設(shè)定在10-42?的范圍，更優(yōu)選30-40°C，進(jìn)一步優(yōu)選36-38°C，這是因為當(dāng)活有機體內(nèi)的溫度變低不少于10°C時(在人類中約30°C)時，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)流動性通常會降低，并且代謝能力會降低，當(dāng)溫度超過42°C時，蛋白質(zhì)會變性且細(xì)胞功能會降低，以及膠原酶的最適溫度大多是37°C，且低于這個水平的溫度會延長溶解時間。
[0057]在膠原方法中，當(dāng)膠原凝膠的溶解進(jìn)行時，細(xì)胞片層逐漸從凝膠上分離，并最終釋放在膠原酶溶液中。為回收細(xì)胞片層，可以將細(xì)胞片層從剩余凝膠上機械分離，或者可以在凝膠完全溶解后進(jìn)行回收。盡管機械分離縮短了細(xì)胞片層回收的時間，但是由于細(xì)胞片層可能被破壞，優(yōu)選在凝膠完全溶解后進(jìn)行回收。
[0058]盡管如上所述回收的細(xì)胞片層可以直接用于血管形成細(xì)胞層的層壓步驟，但是由于殘余膠原酶可能抑制對血管形成細(xì)胞層的粘附，優(yōu)選用培養(yǎng)基或具有緩沖能力的等滲溶液進(jìn)行沖洗。清洗期間的溫度可以根據(jù)經(jīng)膠原酶的膠原凝膠溶解處理來確定。為充分除去殘余的膠原酶，優(yōu)選將片層用培養(yǎng)基或具有緩沖能力的等滲溶液沖洗一次或多次。
[0059]在由通過膠原方法所獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層中，特異于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子以與活生物體中類似的極性進(jìn)行分泌，以及細(xì)胞間緊密粘附結(jié)合指標(biāo)的跨上皮電阻(TER)如活生物體內(nèi)那樣上升。因此，它具有類似于活生物體內(nèi)的細(xì)胞層屏障功能。根據(jù)膠原方法，可以獲得由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成并具有類似于活生物體內(nèi)的那些功能的細(xì)胞片層。
[0060]在通過膠原方法所獲得的細(xì)胞片層中，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之間形成了緊密連接，并且在與膠原凝膠的接觸面上形成了基底膜。在本說明書中，“基底膜”是從視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的組分而形成的膜，以及意指包含至少一部分基底膜組分的膜(后文稱為“視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞基底膜”)。活生物體中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的基底膜是作為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和構(gòu)成布魯赫膜的內(nèi)膠原層之間的薄膜而存在的，并且是具有IV型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(perlecan)、巢蛋白等作為代表性組分的細(xì)胞外基質(zhì)。布魯赫膜是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和脈絡(luò)膜之間的薄膜，并具有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞基底膜、內(nèi)膠原層、彈性蛋白層、外膠原層、以及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管板基底膜的5層結(jié)構(gòu)。由通過膠原方法所獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層包含布魯赫膜結(jié)構(gòu)的一部分(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞基底膜)。緊密連接的形成可以通過觀察六邊形緊密粘附的細(xì)胞形式、以及通過免疫染色觀察細(xì)胞之間緊密連接蛋白(occludin)、Z0-l等的表達(dá)來確認(rèn)?；啄さ男纬煽赏ㄟ^免疫染色觀察基底膜標(biāo)志物諸如層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(perlecan)、巢蛋白、或IV型膠原等在細(xì)胞表面上的表達(dá)，或者用掃描電子顯微鏡觀察來確認(rèn)。
[0061]通常，培養(yǎng)在培養(yǎng)皿上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞會產(chǎn)生基底膜組分，但很難將細(xì)胞以可用的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的形式從培養(yǎng)皿上分離(Invest.0phthalmol.Vis.Sc1., 36(2)，1995，381-390)。根據(jù)膠原方法，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所生產(chǎn)的基底膜一起可以作為片層回收，而不利用人工膜。由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成單層結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)它們被單獨處理時，片層結(jié)構(gòu)會解體，以及細(xì)胞會分散成細(xì)胞單元。因此，其作為片層的移植是極困難的。另一方面，由于由通過膠原方法所獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層伴隨有基底膜，并具有足夠的剛度，所以在回收期間不易起皺，這使得其處理非常容易。結(jié)果，由于血管形成細(xì)胞層的層壓操作能夠平穩(wěn)進(jìn)行，以及安裝細(xì)胞移植器件和移植操作都能夠平穩(wěn)進(jìn)行，因此細(xì)胞移植可以以最小侵入進(jìn)行，以及效果和預(yù)后兩者都預(yù)期得到改善。另外，由于由通過膠原方法所獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成的細(xì)胞片層伴隨有基底膜，因此對于其中基底膜同時患病的疾病中的移植來說是極為有利的。例如，年齡相關(guān)性黃斑變性有時伴隨有布魯赫膜病。當(dāng)將通過膠原方法所獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層用作本發(fā)明上述生產(chǎn)方法中的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層時，由該方法生產(chǎn)的細(xì)胞片層的基底膜補償了病性部分，由此細(xì)胞片層的植活率能夠得到改善，并且其治療效果也可預(yù)期。因此，在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，當(dāng)將通過膠原方法獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層用作視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層時，所生產(chǎn)的細(xì)胞片層優(yōu)選作為用于帶有病性基底膜的疾病的移植的片層，并且可以優(yōu)選用作特別是靶向年齡相關(guān)性黃斑變性的移植片層。
[0062]膠原方法可進(jìn)一步包含以下步驟(3):
(3)確認(rèn)已分離的細(xì)胞片層和膠原凝膠之間的接觸面上基底膜的存在與否。
[0063]在步驟(3)中，具有由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和基底膜所構(gòu)成的細(xì)胞層的細(xì)胞片層的形成可通過細(xì)胞片層基底膜的存在與否來確認(rèn)。基底膜的存在與否可通過類似于基底膜形成的前述確認(rèn)方法進(jìn)行確認(rèn)，例如，基底膜標(biāo)志物的表達(dá)、用掃描電子顯微鏡觀察等等。對于基底膜檢測來說，基底膜標(biāo)志物的表達(dá)可以在細(xì)胞的任何部位(例如，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、核膜等)進(jìn)行確認(rèn)。優(yōu)選地，在與膠原凝膠