的IC50在圖中顯示為插注。
[0041] 圖17A是描述在用1 yM濃度的E170G溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)〇ATPlBl*la或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中雌二醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸 收的時(shí)間依賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0042] 圖17B是描述在用lyM濃度的E3S溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)〇ATPlBl*la或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中雌酮-3-硫酸鹽（E3S)吸收的時(shí)間依 賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0043] 圖17C是描述在用lyM濃度的羅蘇伐他汀溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15 分鐘）后，過表達(dá)〇ATPlBl*la或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中羅蘇伐他汀吸收的時(shí)間依賴性 測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0044] 圖17D是描述其中測(cè)量在溫育1分鐘后，過表達(dá)0ATPlBl*la的HEK293細(xì)胞對(duì)濃 度為0. 25-40 yM的E17 G的吸收的濃度依賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計(jì)算 的Km和Vmax在圖中顯示為插注。
[0045] 圖17E是描述其中測(cè)量在溫育5分鐘后，過表達(dá)0ATPlBl*la的HEK293細(xì)胞對(duì)濃 度為0. 78-50 yM的羅蘇伐他汀的吸收的濃度依賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計(jì) 算的Km和Vmax在圖中顯示為插注。
[0046] 圖17F是描述其中測(cè)量在使用0. 04-30 y M濃度的抑制劑環(huán)孢菌素A溫育5分鐘 后，過表達(dá)〇ATPlBl*la的HEK293細(xì)胞對(duì)1 y M濃度的E17 G的吸收的抑制測(cè)定的結(jié)果的 圖。使用Sigma-plot計(jì)算的IC50在圖中顯示為插注。
[0047] 圖18A是描述在用lyM濃度的E170G溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15分 鐘）后，過表達(dá)〇ATPlBl*lb或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中E17 0 G吸收的時(shí)間依賴性測(cè)定 的結(jié)果的圖。
[0048] 圖18B是描述在用lyM濃度的E3S溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)〇ATPlBl*lb或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中E3S吸收的時(shí)間依賴性測(cè)定的結(jié)果的 圖。
[0049] 圖18C是描述在用lyM濃度的羅蘇伐他汀溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15 分鐘）后，過表達(dá)〇ATPlBl*lb或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中羅蘇伐他汀吸收的時(shí)間依賴性 測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0050] 圖18D是描述其中測(cè)量在溫育1分鐘后，過表達(dá)0ATPlBl*lb的HEK293細(xì)胞對(duì)濃 度為0. 25-40 yM的E17 G的吸收的濃度依賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計(jì)算 的Km和Vmax在圖中顯示為插注。
[0051] 圖18E是描述其中測(cè)量在使用0. 04-30 yM濃度的抑制劑環(huán)孢菌素A溫育5分鐘 后，過表達(dá)〇ATPlBl*lb的HEK293細(xì)胞對(duì)濃度為1 y M的E17 G的吸收的抑制測(cè)定的結(jié)果 的圖。使用Sigma-plot計(jì)算的IC50在圖中顯示為插注。
[0052] 圖19A是描述在用lyM濃度的CCK-8溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15分鐘） 后，過表達(dá)0ATP1B3或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中縮膽囊肽（CCK-8)吸收的時(shí)間依賴性測(cè) 定的結(jié)果的圖。
[0053] 圖19B是描述在用lyM濃度的E170G溫育不同的時(shí)間（即1、2、5、10和15分 鐘）后，過表達(dá)0ATP1B3或pCMV載體的HEK293細(xì)胞中E17 0 G吸收的時(shí)間依賴性測(cè)定的結(jié) 果的圖。
[0054] 圖19C是描述其中測(cè)量在溫育1分鐘后，過表達(dá)0ATP1B3的HEK293細(xì)胞對(duì)濃度為 0. 5-20 yM的CCK-8的吸收的濃度依賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計(jì)算的Km和 Vmax在圖中顯示為插注。
[0055] 圖19D是描述其中測(cè)量在溫育5分鐘后，過表達(dá)0ATP1B3的HEK293細(xì)胞對(duì)濃度為 0. 78-50 yM的羅蘇伐他汀的吸收的濃度依賴性測(cè)定的結(jié)果的圖。使用Sigma-plot計(jì)算的 Km和Vmax在圖中顯示為插注。
[0056] 圖19E是描述其中測(cè)量在使用0. 04-30 y M濃度的抑制劑環(huán)孢菌素A溫育2分鐘 后，過表達(dá)0ATP1B3的HEK293細(xì)胞對(duì)濃度為1 y M的CCK-8的吸收的抑制測(cè)定的結(jié)果的圖。 使用Sigma-plot計(jì)算的IC50在圖中顯示為插注。
[0057] 發(fā)明詳述
[0058] 如本文中所用的下列術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有示于下文的定義。
[0059] 如本文中所用，術(shù)語"細(xì)胞"包括原代細(xì)胞以及所建立的細(xì)胞系（例如，人胚腎 HEK293細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO、Madin-Darby犬腎細(xì)胞MDCK、豬腎上皮細(xì)胞LLC-PK1、人上 皮結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2和中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞V79細(xì)胞）。
[0060] 如本文中所用，術(shù)語"藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白"是指膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其包括但不限于ATP 結(jié)合框（ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和溶質(zhì)運(yùn)載體（SLC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0061] 如本文中所用，術(shù)語"藥物代謝酶"包括但不限于：細(xì)胞色素例如細(xì)胞色素（CYP) P450 ;UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶和其它的非CYP藥物代謝酶例如醇脫氫酶、單胺氧化酶和 醛氧化酶。
[0062] 如本文中所用，術(shù)語"可檢測(cè)的"意指用藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和/或藥物代謝酶轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞中，所選擇的探針底物的活性應(yīng)當(dāng)比用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的相同的探針底物的活性更 高；期望地，活性的差異將為至少5倍。
[0063] 如本文中所用，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白命名中大與字母的使用標(biāo)識(shí)人蛋白/基因，即MRP2/ ABCC2等；小寫字母表示轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來源于臨床前（非人哺乳動(dòng)物）物種，即Mrp2/Ab CC2等。 除非另有指明，否則基因來源于任何物種（例如人或其它哺乳動(dòng)物）。
[0064] 如本文中所用，術(shù)語"0ATP1B1 "、"0ATP2"和"SLC01B1 "是可互換使用的并且是指 對(duì)應(yīng)于非人蛋白/基因0atp2的人蛋白/基因。除非另有指明，否則0ATP1B1的使用是指 0ATPlBl*lb。
[0065] 如本文中所用，術(shù)語"0AT1"和"SLC22A6"是可互換使用的并且是指有機(jī)陰離子轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白1。除非另有指明，否則0AT1的使用是指編碼563個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)cDNA(在本文中 也被稱作"長(zhǎng)0AT1"）。
[0066] 示例性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括但不限于列于下表1中的那些。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含一種或多種瞬時(shí)過表達(dá)基因的低溫保存的重組細(xì)胞，所述基因編碼選自藥物轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白和藥物代謝酶或其組合的蛋白，其中所述藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或藥物代謝酶或組合的活性 在從低溫保存中解凍后的所述低溫保存的重組細(xì)胞的群體中是可檢測(cè)的。
2. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種基因編碼藥物代謝酶。
3. 權(quán)利要求2的重組細(xì)胞，其中所述藥物代謝酶選自細(xì)胞色素P450、UDP-葡萄糖醛酸 基轉(zhuǎn)移酶、醇脫氫酶、單胺氧化酶和醛氧化酶。
4. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其瞬時(shí)過表達(dá)一種或多種編碼選自ATP結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和 溶質(zhì)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白的基因。
5. 權(quán)利要求4的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種基因選自MDRl/Mdrla/Mdrlb、MRPl/ MrpI、MRP2/Mrp2、MRP3/Mrp3、MRP4/Mrp4、MRP5/Mrp5、MRP6/Mrp6、MRP7/Mrp7、MRP 8/Mrp8、 BCRP/Bcrp、BSEP/Bs印、0ATP2/0atp2、0ATPlB3/0atplb3、OATl/Oatl、0AT2/0at2、0AT3/ 0at3、0AT4/0at4、OCT1/OctI、0CT2/0ct2、OATP1/OatpI、PEPT1/P印11、PEPT2/P印t2、OCTNl/ OctnI、0CTN2/0ctn2、MATE1/MateI、MATE2K/Mate2、URAT1/UratI、ASBT/Asbt 和 NTCP/Ntcp。
6. 權(quán)利要求4的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種基因編碼蛋白，所述蛋白是選自下 列的 ATP 結(jié)合框轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：MDRl/Mdrla/Mdrlb、MRPl/Mrpl、MRP2/Mrp2、MRP3/Mrp3、MRP4/ Mrp4、MRP5/Mrp5、MRP6/Mrp6、MRP7/Mrp7、MRP 8/Mrp8、BCRP/Bcrp 和 BSEP/Bs印。
7. 權(quán)利要求4的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種基因編碼蛋白，所述蛋白是選自下列 的溶質(zhì)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：0ATP2/0atp2、0ATPlB3/0atplb3、OATl/Oatl、0AT2/0at2、0AT3/ 0at3、0AT4/0at4、OCTl/Octl、0CT2/0ct2、0CT3/0ct3、OATPl/Oatpl、PEPT1/P印tl、PEPT2/ P印t2、0CTNl/0ctnl、0CTN2/0ctn2、MATEl/Matel、MATE2K/Mate2、URATl/Uratl、ASBT/Asbt 和 NTCP/Ntcp。
8. 權(quán)利要求4的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種基因選自0ATPlBl*la、0ATPlBl*lb、 0ATP1B3、0AT1、0AT3、0CT1、0CT2、MATE1 和 MATE2K。
9. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種基因各自來源于人或選自小鼠、大鼠、 豚鼠、狗和猴的動(dòng)物物種。
10. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來源于哺乳動(dòng)物。
11. 權(quán)利要求10的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自J1EK293、CHO、MDCK、LLC-PK1、Caco-2 和V79細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求10的重組細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物選自人、猴、狗、大鼠、小鼠、豬和倉(cāng)鼠。
13. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括肝細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞。
15. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述蛋白的活性在從低溫保存中解凍后的平板接種 之后至少24小時(shí)的所述細(xì)胞的群體中是可檢測(cè)的。
16. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述蛋白的活性在從低溫保存中解凍后的平板接種 之后至少48小時(shí)的所述細(xì)胞的群體中是可檢測(cè)的。
17. 權(quán)利要求1的重組細(xì)胞，其中所述蛋白的活性在從低溫保存中解凍后的平板接種 之后至少72小時(shí)的所述細(xì)胞的群體中是可檢測(cè)的。
18. 制備瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞的方法，其中所述重組細(xì)胞瞬時(shí)過表達(dá)一種或多種編碼 選自藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物代謝酶的蛋白的基因，所述方法包括用一種或多種編碼藥物轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白或藥物代謝酶的基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和在轉(zhuǎn)染的48小時(shí)內(nèi)低溫保存瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的重組細(xì) 胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟包括電穿孔。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于篩選藥物候選物的低溫保存的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞瞬時(shí)過表達(dá)一種或多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和/或藥物代謝酶。有利地，這樣的細(xì)胞提供成本效率的可消耗產(chǎn)品，其流水線化篩選藥物候選物是否是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和/或藥物代謝酶的底物或抑制劑的過程。
【IPC分類】C12N5-10
【公開號(hào)】CN104755612
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380057012
【發(fā)明人】李娜, 王潔, C·J·帕特恩
【申請(qǐng)人】康寧有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2013年9月11日
【公告號(hào)】EP2895598A1, US20150184196, WO2014043170A1, WO2014043170A8