23000 rpm離心20 min,取上清液用0.45 iim濾膜過(guò)濾后進(jìn)行蛋白純 化。純化方法如下： (1)取適量鎳珠基質(zhì)上柱，使基質(zhì)里的無(wú)水乙醇在重力作用下充分流出。
[0078] (2)用20 mL無(wú)菌ddH20沖洗柱子。
[0079] (3)用20 mL HEPES緩沖液平衡柱子。
[0080] (4)將含有目標(biāo)蛋白的上清液加入柱子中，收集流穿液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
[0081] (5)分別以含 2 mM、5 mM、25 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM 和 500mM 咪唑的洗 脫液(用ffiPES緩沖液稀釋的咪唑溶液）進(jìn)行洗脫，收集流出液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
[0082] SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示用含50 mM和100 mM咪唑的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，獲得 較純的蛋白（圖4)。用10kDa的超濾濃縮管濃縮該較純的蛋白溶液至2.5 mL后，用GE Healthcare的ro-10脫鹽柱(貨號(hào)為17-0851-01)對(duì)濃縮后的蛋白溶液進(jìn)行脫鹽處理，具體 操作如下： (1)用10 mL平衡緩沖液平衡柱子，棄廢液，重復(fù)4次。
[0083] (2)加入2.5 mL蛋白液至完全浸入柱子，棄廢液。
[0084] (3 )加入3. 5mL洗脫液并收集流出液(該流出液即為完成脫鹽處理的蛋白溶 液）-80°C保藏備用。
[0085] 實(shí)施例3 AuOS蛋白的功能分析 為了確定AuOS蛋白的功能，以美國(guó)Sigma-Aldrich公司的DMAPP (二甲基烯丙基焦磷 酸)、GPP (香葉基焦磷酸)，F(xiàn)PP (法尼基焦磷酸）和GGPP (香葉基香葉基焦磷酸）為底物，分 別添加IPP (異戊烯焦磷酸)來(lái)設(shè)計(jì)體外反應(yīng)。反應(yīng)體系（50 iiL):220 iiMDMAPP (或GPP、 FPP、GGPP)，340 iiM IPP，0. 1 M Tris-HCl (pH 7.4)、2 mM DTT (二硫蘇糖醇）、5 mM MgCl2 和9.4 iiMAu0S，30 °C反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，用等體積乙酸乙酯萃取3次，用氮吹儀將有 機(jī)溶劑吹干，50 yL乙酸乙酯溶解后進(jìn)行GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜）檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下： (1)以DMAPP和IPP為底物按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行體外反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用上述方法處理 后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)分析色譜圖，在T=16. 986 min時(shí)檢測(cè)到蛇孢假殼素類化 合物母核的吸收峰，通過(guò)分析質(zhì)譜圖，得到蛇孢假殼素類化合物母核的特征質(zhì)荷比（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase fromAspergillus c/aFates. Organic Letters. 2013，15 (3)，594-597)(如 m/z=55、69、81、95、121、135、 147、229、247、325、358等)，色譜圖如圖5所示，質(zhì)譜圖如圖6所示。
[0086] (2)以FPP和IPP為底物按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行體外反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用上述方 法處理后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)分析色譜圖，在T=16. 974 min時(shí)檢測(cè)到蛇孢 假殼素類化合物母核的吸收峰，通過(guò)分析質(zhì)譜圖，得到蛇孢假殼素類化合物母核的特征 質(zhì)荷 t匕（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase fromAspergillus clavatus.Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597)(如 m/z=55、 69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等)，色譜圖如圖7所示，質(zhì)譜圖如圖8所示。 [0087] (3)以GPP和IPP為底物按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行體外反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用上述方 法處理后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)分析色譜圖，在T=16. 983 min時(shí)檢測(cè)到蛇孢 假殼素類化合物母核的吸收峰，通過(guò)分析質(zhì)譜圖，得到蛇孢假殼素類化合物母核的特征 質(zhì)荷 t匕（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase fromAspergillus clavatus.Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597)(如 m/z=55、 69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等)，色譜圖如圖9所示，質(zhì)譜圖如圖10所示。 [0088] (4)以GGPP和IPP為底物按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行體外反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用上述方 法處理后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)分析色譜圖，在T=16. 978 min時(shí)檢測(cè)到蛇孢 假殼素類化合物母核的吸收峰，通過(guò)分析質(zhì)譜圖，得到蛇孢假殼素類化合物母核的特征 質(zhì)荷 t匕（Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase fromAspergillus clavatus.Organic Letters. 2013, 15 (3), 594-597)(如 m/z=55、 69、81、95、121、135、147、229、247、325、358等)，色譜圖如圖11所示，質(zhì)譜圖如圖12所示。
[0089]以上結(jié)果表明AuOS蛋白能用DMAPP、GPP、FPP和GGPP這4種化合物為底物，分別 添加IPP時(shí)合成蛇孢假殼素類化合物的母核。由此可知AuOS蛋白同時(shí)具有催化底物鏈長(zhǎng) 延伸和結(jié)構(gòu)環(huán)化的功能，能夠以DMAPP從頭合成C5-C8-C5駢環(huán)母核結(jié)構(gòu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛇孢假殼素類化合物母核合成基因，其特征在于：為焦曲霉094102的A/05基 因，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛇孢假殼素類化合物母核合成基因，其特征在于：所述的 如05基因的cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的蛇孢假殼素類化合物母核合成基因編碼的AuOS蛋白，其特征 在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示。
4. 一種表達(dá)權(quán)利要求3所述的AuOS蛋白的載體，其特征在于：為含有權(quán)利要求1或2 所述基因的真核或原核表達(dá)載體。
5. -種表達(dá)權(quán)利要求3所述的AuOS蛋白的宿主細(xì)胞，其特征在于：含有權(quán)利要求4所 述的載體。
6. 權(quán)利要求1或2所述的基因或權(quán)利要求3所述的蛋白在制備蛇孢假殼素類化合物中 的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1或2所述的基因或權(quán)利要求3所述的蛋白在研究蛇孢假殼素類化合物的 生物合成途徑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蛇孢假殼素類化合物母核合成基因AuOS及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。該蛇孢假殼素類化合物母核合成基因AuOS來(lái)源于焦曲霉094102，其基因序列、cDNA序列和編碼的AuOS蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1-3所示。AuOS蛋白具有催化底物鏈長(zhǎng)延伸和結(jié)構(gòu)環(huán)化的功能，該蛋白能以DMAPP、GPP、FPP和GGPP這4種化合物為底物與IPP反應(yīng)生成蛇孢假殼素類化合物母核。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了焦曲霉094102的AuOS基因，其編碼蛋白具有催化底物鏈長(zhǎng)延伸和結(jié)構(gòu)環(huán)化的功能，能以DMAPP為底物從頭合成蛇孢假殼素類化合物母核，可用于蛇孢假殼素類化合物的制備及其生物合成途徑的研究。
【IPC分類】C12N9-10, C12R1-70, C12N1-21, C12N15-54, C12P1-02, C12N15-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104673813
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510130163
【發(fā)明人】洪葵, 孟會(huì)影, 柴沆鎮(zhèn), 殷如, 鄧子新
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月24日