一種蛇孢假殼素類化合物母核合成基因AuOS及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種從焦曲霉094102 ( 094102)中克隆得到的蛇孢假殼素（ophiobolin)類化合物母核合成基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 1957年Orsenigo從植物病原真菌orjzae中分離到第一個(gè)蛇孢假 殼素類化合物，即蛇抱假殼素 A (M. 0RSENIG0. Estrazione e purificazione della cochliobolina, una tossina prodotta daHelmintosporiumoryzae.Phytopath. Z. 1957，29，189 - 196)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)該類化合物30余種，其來(lái)源菌株均屬于絲狀真 菌。
[0004] 蛇孢假殼素（ophiobolin)類化合物屬于二倍半萜烯化合物，其結(jié)構(gòu)特征是均具 有一個(gè)三輪列的C5-C8-C5環(huán)母核結(jié)構(gòu)（圖1)。到目前為止發(fā)表的具有C5-C8-C5環(huán)母核結(jié) 構(gòu)的蛇孢假殼素類化合物主要有蛇孢假殼素A、C、F、H、M、L (M. 0RSENIG0. Estrazione e purificazione della cochliobolina, una tossina prodotta daHelmintosporium oryzae.Phytopath. Z. 1957，29，189 - 196)、蛇孢假殼素 0、Q、R、S (CL Tipton，T Tovrea, G Whitehurst. The effect of ophiobolin A on glucose uptake by animal cells. Nutr. Rep. Int. 1981，23:723-727)等。該類化合物顯示廣譜的抗菌活性(如抗真菌、 抗細(xì)菌)和抗線蟲(chóng)、抗病毒等活性，此外還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有顯著細(xì)胞毒活性。據(jù)報(bào)道， 該家族的蛇孢假殼素〇不僅能抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖（Tingting Yang, Zhenyu Lu，Li Meng，et al. The novel agent ophiobolin 0 induces apoptosis and cell cycle arrest of MCF-7 cells through activation of MAPK signaling pathways. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2012，22，579 - 585)，還能逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐 藥細(xì)胞株MCF-7/ADR對(duì)阿霉素的耐藥性（Wenxia Sun，Cuiting Lv，Tonghan Zhu，et al. 0phiobolin-〇 reverses adriamycin resistance via cell cycle arrest and apoptosis sensitization in adriamycin-resistant human breast carcinoma (MCF-7/ADR) cells. Marine Drugs. 2013，11，4570 - 4584)。
[0005] 由于蛇孢假殼素類化合物廣泛而重要的生物活性，提高該類化合物的產(chǎn)量以及闡 明其合成機(jī)制的研究引起了關(guān)注。從1992年開(kāi)始陸續(xù)有關(guān)于蛇孢假殼素類化合物及其母 核化學(xué)合成的報(bào)道，但該類化合物的復(fù)雜結(jié)構(gòu)使其化學(xué)合成的研究極具挑戰(zhàn)性，到目前僅 完成了蛇抱假殼素 A 的全合成（Kazuhiro Tsuna，Naoyoshi Noguchi，Masahisa Nakada. Enantioselective total synthesis of (+)-ophiobolin A. Chemistry-A European Journal. 2013，19，5476 - 5486; Ke Li, Cheng Wang, Gang Yin，et al. Construction of the basic skeleton of ophiobolin A and variecolin. Organic & Biomolecular Chemistry. 2013，11，7550 - 7558)，而且合成步驟繁瑣不易操作。
[0006] 從蛇孢假殼素類化合物的生物合成機(jī)制入手，利用其生物合成相關(guān)基因的超表 達(dá)或異源表達(dá)來(lái)提高該類化合物產(chǎn)量的相關(guān)研究顯得更有價(jià)值。從1967年到1969年， Canonica (L Canonica，A. Fiecchi，M. G. Kienle，et al. Tetrahedron Letters. 1967，35，3371-3376)和Nozoe(S. Nozoe，M. Morisaki，S. Okuda，et al. Tetrahedron Letters. 1968， 19， 2347-2349; S. Nozoe, M. Morisaki. Chemical Communications. 1969，1319-1320.)等利用同位素標(biāo)記初步確定蛇孢假殼素類化合物的三環(huán)母核來(lái)自香葉 基法尼基焦磷酸（GFPP)的成環(huán)，但未涉及到蛇孢假殼素類化合物合成相關(guān)的基因或酶。直 到2013年，Ryota等為了挖掘新代謝產(chǎn)物，用orjzae表達(dá)系統(tǒng)對(duì)來(lái)自棒曲霉 NRRL chratesNRRL 1)的似5C基因進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)主體產(chǎn)物 是蛇抱假殼素F(Ryota Chiba, Atsushi Minami, Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase from Organic Letters. 2013，15 (3)，594-597)，證明了該 GGPPS就是AcOS (A c/arates NRRL 1 ophiobolin F合成酶)。這是蛇孢假殼素類化合 物生物合成相關(guān)酶的首次報(bào)道。AcOS屬于嵌合型萜類合成酶，其N端和C端分別包含萜類 合成酶結(jié)構(gòu)域和A-IPPS (反式異戊烯基焦磷酸合成酶）結(jié)構(gòu)域。但其酶學(xué)方面研究并不深 入，例如有關(guān)萬(wàn)-IPPS結(jié)構(gòu)域的底物專一性的研究，即該結(jié)構(gòu)域更傾向于識(shí)別并結(jié)合四種底 物即二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP)、香葉基焦磷酸（GPP)、法尼基焦磷酸（FPP)和香葉基香 葉基焦磷酸（GGPP)中的哪一種尚有待明確。
[0007] 目前已知蛇孢假殼素類化合物的母核均包含三輪列的C5-C8-C5環(huán)，但母核包含 的烯鍵數(shù)目和位置卻不盡相同，如蛇孢假殼素E比蛇孢假殼素F多出（： 1(|-(：14和C 12-C13兩個(gè) 烯鍵，暗示其成環(huán)機(jī)制并非完全相同。因此有必要挖掘更多蛇孢假殼素類化合物母核合成 相關(guān)蛋白，從系統(tǒng)研究角度深入探討其成環(huán)機(jī)理。但目前僅有棒曲霉NRRL 1菌株中蛇孢假 殼素F合成酶的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種蛇孢假殼素類化合物母核合成基因，本發(fā)明的目的還 在于提供該基因的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種蛇孢假殼素類化合物母核合成基因，為焦曲霉094102 (保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 208153)中克隆得到的基因，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的基因含有 3個(gè)內(nèi)含子，其cDNA大小為2178bp，序列如SEQ ID N0. 2所示。所述的蛇孢假殼素類化合 物包括具有一個(gè)三輪列的C5-C8-C5環(huán)母核結(jié)構(gòu)特征的一系列蛇孢假殼素類化合物，如蛇 孢假殼素K、6_表蛇孢假殼素K、蛇孢假殼素G、6_表蛇孢假殼素G、6_表蛇孢假殼素Q、蛇孢 假殼素U、6-表蛇孢假殼素V和蛇孢假殼素W等。
[0010] 所述的基因編碼的蛋白，命名為AuOS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所 示。AuOS蛋白包含了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端約324個(gè)氨基酸組成的萜類合成酶結(jié)構(gòu)域和C端 約401個(gè)氨基酸組成的iMPPS (反式異戊烯基焦磷酸合成酶）結(jié)構(gòu)域。其中，萜類合成酶 結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)用于識(shí)別Mg2+和底物的特征性保守基序DDEID和NDLFSYEKE，萬(wàn)-IPPS結(jié)構(gòu) 域也含有兩個(gè)具有相似功能的特征性保守基序DDIED和DDYQN。
[0011] 本發(fā)明所述的AuOS蛋白可通過(guò)用各種表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌和鏈霉菌等所有原 核表達(dá)系統(tǒng)，以及畢赤酵母、釀酒酵母和米曲霉等所有真核表達(dá)系統(tǒng))對(duì)基因進(jìn)行異源 表達(dá)得到，同時(shí)AuOS蛋白可通過(guò)用各種純化方法(如鎳離子金屬螯合親合層析等）得到。
[0012] 上述AuOS蛋白具有催化底物鏈長(zhǎng)延伸和結(jié)構(gòu)環(huán)化的