047] PCR擴(kuò)增條件為：95 °C預(yù)變性3min;95 °C變性30 s ;53 °C退火20 s，72 °C延 伸70 s，35個(gè)循環(huán)；72 °C充分延伸10min。
[0048] 4、目的DNA回收 PCR產(chǎn)物電泳后，按照德國OMEGA公司的Gel Extraction Kit(100)(貨號(hào)： D2500-01)的說明書，從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段。具體操作步驟如下： (1)使用三羥甲基氨基甲烷-乙酸(簡稱為TAE)緩沖液制作1. 0%的瓊脂糖凝膠，對(duì)目 的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
[0049] (2)在紫外燈下切下含有目的DNA片段的凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體(此時(shí) 應(yīng)盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率)。
[0050] (3)切碎膠塊(膠塊切碎后可以加快膠塊融化時(shí)間，提高DNA回收率)。
[0051] (4)稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。按每100 mg瓊脂糖凝膠400 ii L的比例加入 Binding buffer, 50-60 °C處理約10 min (每隔2 min混勻一次，直至膠塊完全融化)。
[0052] (5)將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到收集管的吸附柱內(nèi)，室溫10000Xg離心1min，棄濾 液。
[0053] (6)加入 500 u L XP2 (Binding buffer)至吸附柱中，室溫 10000Xg 離心 1 min, 倒掉收集管中的濾液，將吸附柱放回到收集管中。
[0054] (7)加入 700 u L SPW (Wash buffer)至吸附柱中，室溫 10000Xg 離 1 min，倒掉 收集管中的濾液，將吸附柱放回到收集管中。
[0055] (8)加入 300 u L SPW (Wash buffer)至吸附柱中，室溫 10000Xg 離心 1 min，倒 掉收集管中的濾液，將吸附柱放回到收集管中。
[0056] (9)室溫10000Xg開蓋離心 2 min。
[0057] (10)將吸附柱放入另一干凈的1.5 mL塑料離心管中，在吸附柱模的中央處加入 30-50 yL Elution buffer或無菌水，室溫放置2-5 min后室溫10000Xg離心1 min。
[0058] (11)回收產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。
[0059] 5、目的DNA的克隆 回收的目的DNA于16 °C與pEASY-Blunt載體連接2-4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后采用快速檢驗(yàn)的方法初步篩選陽性克隆子，方法如下： (1)用無菌牙簽在轉(zhuǎn)化平板上挑取約20個(gè)單克隆子，在含有氨芐抗性（100 y g/mL)的LA平板上劃線，于37 °C培養(yǎng)8h。
[0060] (2)在1. 5 mL塑料離心管中加入30 ii L STE溶液（20 mM Tris-HCl，25 mM EDTA， 75 mM NaCl)，用牙簽將擴(kuò)大培養(yǎng)后的單克隆子分別挑取到上述塑料離心管中渦旋處理約 2min，使其充分混勻。
[0061] (3)加入等體積氯仿：酚：異戊醇（v:v:v=24:25:1)，輕搖混勻后，室溫lOOOOXg 離心5min。
[0062] (4)上清液用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，初步確定克隆子含有的質(zhì)粒是否插入外 源片段。
[0063] 用武漢麥克萊博生物科技有限公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒對(duì)含有外源片段的克 隆子進(jìn)行質(zhì)粒抽提，具體操作如下： (1)將單克隆子接入含氨芐抗性（100yg/mL)的5 mL LB培養(yǎng)基中，于37 °C條件下， 220 r/min過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移2 mL菌液至2 mL塑料離心管中，于室溫12000Xg離心1 min, 棄上清。
[0064] (2)加入250 iiL Buffer 1，于漩渦振蕩器上劇烈震蕩，使菌體充分重懸。
[0065] (3)加入250 iiL Buffer 2,溫和顛倒離心管5-6次，直到體系變清亮為止。
[0066] (4)加入350 y L Buffer 3,溫和顛倒離心管3-5次以充分混勻。
[0067] (5)室溫12000Xg離心10min，將上清液小心轉(zhuǎn)入收集管的吸附柱中，室溫 12000Xg離心1 min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放回收集管。
[0068] (6)加入500iiL Buffer D，室溫12000Xg離心1 min，倒掉收集管中的液體，將 吸附柱放回收集管。
[0069] (7)加入600 ii L Buffer W，室溫12000Xg離心1 min，倒掉收集管中的液體，將 吸附柱放回收集管。
[0070] (8)再次加入 300 ii L BufferW，室溫 12000Xg 離心 1 min。
[0071] (9)將吸附柱轉(zhuǎn)移到另一干凈1.5 mL塑料離心管中，在吸附膜的中央處懸空加入 50-100 iiL Buffer E后室溫靜置1 min，室溫12000Xg離心1 min洗脫克隆子的質(zhì)粒。
[0072] 將獲得的質(zhì)粒用美國New England Biolabs公司的高保真限制性內(nèi)切酶M/el和 [雙酶切（2uLCutsmart buffer，0? 5 uLUeI，0? 5 uL//ifldll，1 UL 質(zhì)粒 DNA，16 yL ddH20,37 °C處理1 h)后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定克隆子攜帶的外 源DNA片段是否是目的DNA片段。取1 mL含有目的DNA片段的克隆子菌液送交擎科測(cè)序 公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)該克隆子的確含有目的DNA片段，且目的DNA片段沒有出現(xiàn)突變。 將該陽性克隆子的重組質(zhì)粒命名為? -BluntlwOS；
[0073] 實(shí)施例2 AuOS蛋白的表達(dá)和純化 1、含基因大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建含A/仍基因的大腸桿菌表達(dá)載體，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，進(jìn)一 步驗(yàn)證JwflS基因的功能。
[0074] 用限制性內(nèi)切酶I和班/?dll從含有目的基因的重組質(zhì)粒/7似分? -Blunt-A/OS中切下目的片段，同時(shí)用I和班/?dll雙酶切pET28a載體，瓊脂糖凝膠 電泳分離后，用OMEGA膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和pET28a載體的大片段。利 用T4 DNA連接酶將基因正向插入到pET28a載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)克隆子快速檢驗(yàn)和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證鑒定后，獲得大腸桿菌重組表達(dá)載體 pET28a-^y(95'〇
[0075] 2、如05基因的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28ady〇S及pET28a質(zhì)粒通過熱激轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌大腸桿 菌BL21 (DE3)中，用武漢麥克萊博生物科技有限公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行質(zhì)粒抽提，經(jīng)限制性內(nèi)切酶#也1和III酶切驗(yàn)證鑒定，成功獲得分別含重組質(zhì)粒 pET28a-JyflS及pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)菌株。
[0076] 分別挑取含重組質(zhì)粒pET28ady〇S及pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)單菌落 接種至含卡那霉素抗性（50 iig/mL)的5 mL LB培養(yǎng)基，于37 °C，220 r/min過夜培養(yǎng)。按 1%的接種量將新鮮菌液接種至含卡那霉素抗性（50 iig/mL)的5 mL LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培 養(yǎng)2-3 h至0D6QQ達(dá)到0. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mM，于37 °C下誘導(dǎo)培養(yǎng)約3-5 h (誘導(dǎo)前分別取出1 mL菌液作為對(duì)照)。分別取出誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液200 yL，加入 5XSDS-PAGE樣品緩沖液煮沸30 min，室溫12000Xg離心10 min，各取10 iiL上清液進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果（圖3)表明目的蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達(dá)。
[0077] 3、Au0S蛋白的純化 取5 mL過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒pET28a1W5的大腸桿菌BL21 (DE3)菌液按1%的接 種量接種至含卡那霉素抗性（50 yg/mL)的500 mL LB培養(yǎng)基中，于37 °C條件下，220 r/ min培養(yǎng)至0D6QQ達(dá)到0. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mM，于37 °C下誘導(dǎo)培養(yǎng)約3-5 h。然后室溫5000 r/min離心5 min收集誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌菌體，用無菌ddH20懸浮 菌體，室溫5000 r/min離心5 min后去除上清(重復(fù)兩次，徹底清洗細(xì)胞)。之后用HEPES 緩沖液懸浮菌體，室溫5000 r/min離心后去除上清。將10 mL HEPES緩沖液加入菌體細(xì)胞 中，充分混勻后將細(xì)胞懸液置冰水浴中超聲(參數(shù)：超聲5 mS，間歇5 mS，功率300 W)處理 30 min。然后室溫