功能，AuOS蛋白能以DMAPP (二甲基烯丙基焦磷酸)、GPP (香葉基焦磷酸)、FPP (法尼基焦磷酸）和GGPP (香葉基香葉基 焦磷酸）這4種化合物為底物，分別添加IPP時直接合成蛇孢假殼素類化合物的母核。
[0013] 基于上述AuOS蛋白具有丨隹化底物鏈長延伸和結(jié)構(gòu)環(huán)化的功能，基因不僅可 以用于進一步解析蛇孢假殼素類化合物的生物合成途徑，而且有助于蛇孢假殼素合成酶酶 學領(lǐng)域的深入研究，同時AuOS蛋白可以催化底物制備蛇孢假殼素類化合物的母核，經(jīng)過氧 化還原等修飾手段得到蛇孢假殼素類化合物，在蛇孢假殼素類化合物的產(chǎn)量提高方面也有 著重要的意義。
[0014] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了焦曲霉094102的基因，其編碼的蛋白可以以DMAPP為底 物從頭合成蛇孢假殼素類化合物母核，可以以體外酶促反應形式或以基因工程菌形式合成 蛇孢假殼素類化合物母核，該母核還可通過化學或生物的方式進行結(jié)構(gòu)修飾而產(chǎn)生系列具 有重要藥用價值的化合物。
【附圖說明】
[0015] 圖1是蛇孢假殼素（ophiobolin)類化合物母核的結(jié)構(gòu)圖。
[0016] 圖2是焦曲霉094102 基因編碼的蛋白AuOS與棒曲霉NRRL 1 AcOS蛋白的 氨基酸序列比對結(jié)果。
[0017] 圖3是基因異源表達蛋白的表達結(jié)果圖，其中，1 :pET28a誘導前，2 :pET28a 誘導后，3 :pET28a-JwflS誘導前，4 :pET28a_ JwflS誘導后，M :Page Ruler Prestained Protein Ladder。
[0018] 圖4是因異源表達蛋白的純化結(jié)果圖，M :Page Ruler Prestained Protein Ladder〇
[0019] 圖5是以DMAPP、IPP為底物體外反應的色譜圖。
[0020] 圖6是以DMAPP、IPP為底物體外反應的質(zhì)譜圖。
[0021] 圖7是以FPP、IPP為底物體外反應的色譜圖。
[0022] 圖8是以FPP、IPP為底物體外反應的質(zhì)譜圖。
[0023] 圖9是以GPP、IPP為底物體外反應的色譜圖。
[0024] 圖10是以GPP、IPP為底物體外反應的質(zhì)譜圖。
[0025] 圖11是以GGPP、IPP為底物體外反應的色譜圖。
[0026] 圖12是以GGPP、IPP為底物體外反應的質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，下述實施例僅用來說明本發(fā) 明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 本發(fā)明所提供的蛇孢假殼素類化合物母核合成基因，是從焦曲霉094102 094102)中克隆得到，命名為基因，其基因序列如SEQ ID NO. 1 所示?；蚝?個內(nèi)含子，其cDNA大小為2178bp，序列如SEQ ID NO. 2所示。A/似 基因編碼的蛋白，命名為AuOS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0029] 從公共數(shù)據(jù)庫上搜索焦曲霉094102 AuOS蛋白的同源序列進行比對，結(jié)果顯 不目標蛋白 AuOS 與來自棒曲霉 NRRL 1 NRRL 1)的 AcOS (A clavatusNRRL 1 ophiobolin F合成酶)（Ryota Chiba， Atsushi Minami， Katsuya Gomi, et al. Identification of ophiobolin F synthase by a genome mining approach: a sesterterpene synthase fromAspergi 11 us clavatus.Organic Letters. 2013， 15 (3)，594-597)同源性較高（65%)。AuOS蛋白屬于嵌合型萜類合成酶，其N端和C端分別包 含約324個氨基酸組成的萜類合成酶結(jié)構(gòu)域和401個氨基酸組成的&IPPS(反式異戊烯基 焦磷酸合成酶）結(jié)構(gòu)域，這兩個保守結(jié)構(gòu)域與其蛋白功能密切相關(guān)。其中，萜類合成酶結(jié)構(gòu) 域含有兩個用來識別Mg 2+和底物的特征性保守基序DDEID和NDLFSYEKE、萬-IPPS結(jié)構(gòu)域也 含有兩個具有相似功能的特征性保守基序DDIED和DDYQN (圖2)。
[0030] 實施例1基因克隆 1、焦曲霉094102菌株的RNA提取 以焦曲霉菌株094102的菌絲為材料，用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit (50)試 劑盒(貨號為74104)提取總RNA，具體操作如下： (1)估算菌絲樣品的用量。每次微量提取一般需要50 mg菌絲。
[0031] (2)用液氮將樣品研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中。
[0032] (3)在離心管中加入 450 u L Buffer RLT (Lysis buffer) (Buffer RLT 使用前 每1 mL加10 yL 巰基乙醇)，在振蕩器上振蕩1-3 min混勻（振蕩器振蕩時必須使管 底溶液振蕩起來)。
[0033] (4)4 °C 13000Xg離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的1. 5mL塑料離心管中 (下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取)。
[0034] (5)加入0. 5倍體積無水乙醇，充分顛倒混勻，制得混合溶液。
[0035] (6)將上述混合溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，4 °C 8000Xg離心15s，棄穿透液。
[0036] (7)將 700 u L Buffer RW1 (wash buffer)加入到離心吸附柱中，4 °C 8000Xg 離心15 s，棄穿透液。
[0037] (8)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管(無RNA酶）中，加入500 iiL Buffer RPE (wash bufTer)，4 °C 8000Xg 離心 15 s，棄穿透液。
[0038] (9)加入 500 u L Buffer RPE (wash buffer) (Buffer RPE 使用前加 4 倍體積無 水乙醇)，4 °C 13000Xg 離心 2 min。
[0039] (10)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管(無RNA酶）中，4 °C 13000Xg離心1 min。
[0040] (11)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1. 5 mL塑料離心管(無RNA酶)中，加入30-50 ii L RNase-free water，4 °C 8000Xg離心1 min，離心管中的溶液即為去除DNA污染的RNA樣 品。
[0041] (12)取40 iiLRNA樣品轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL塑料離心管(無RNA酶)中，加DNase I 和 DNase I buffer 各 5 iiL，37 °C處理 2 h。
[0042] (13)加入 5 iiL 50 mM EDTA，65 °C處理 10 min 后-80 °C保存。
[0043] 2、反轉(zhuǎn)錄 米用美國賽默飛世爾科技公司的Revert Aid First strand cDNA synthesis kit(貨 號為K1621)進行反轉(zhuǎn)錄，操作步驟如下： (1)取上述制備的 RNA 樣品 2 iig，加入 liiL lOiiM 01igo(dT)18，RNase-free water 補足至12 iiL，65 °C處理5 min后置冰上冷卻5 min，4 °C 13000Xg離心2 min。
[0044] (2)加入 4 u L 5XReaction buffer，1 u L Ribo Lock RNase Inhibitor，1 u L RevertAid RT，2 uL 10 mM dNTP Mix，RNase-free water 補足至 20 uL。42 °C處理 60 min 后 70 °C處理 5 min。
[0045] 3、如05基因的擴增 根據(jù)焦曲霉094102菌株的基因組測序結(jié)果，設計擴增基因的引物： 正向引物如似_F:5' -CATATGATGGAGTATAAGTACTCGACC-3'(為了便于其表達載體的構(gòu) 建，引入酶切位點Mfcl ); 反向引物如似-R:5' -AAGCTTTCAAACCTTCAGCAGCTCCA-3'（為了便于其表達載體的構(gòu) 建，引入酶切位點^Z/?dII)。
[0046]反應體系為：1 iiL美國New England Biolabs公司的Pfu高保真DNA聚合酶，21 iiL滅菌去離子水，1 yLPfu高保真DNA聚合酶自帶的5XNF buffer,正向、反向引物各 2. 5 ii L (10 ii M)，cDNA 模板 2 ii L。
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