豬肌肉生長抑制素基因打靶載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種豬肌肉生長抑制素基因打靶 載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN)是轉(zhuǎn)化生長因子0 (Transforming Growth Factor-0，TGF-0)超家族成員，是一種作為肌肉生長負(fù)調(diào)控因子的分泌型蛋白。在胚胎 發(fā)育過程中，MSTN在生肌節(jié)細(xì)胞和發(fā)育的骨骼肌中表達(dá)，調(diào)控形成肌纖維的最后數(shù)量。在 成年動物體內(nèi)，MSTN主要在骨骼肌中特異表達(dá)，并控制肌纖維的生長。MSTN的基因敲除和 自然純合突變在小鼠、牛、狗和人類中均表現(xiàn)出骨骼肌的顯著增加。
[0003]MSTN是以一種前體蛋白的形式被合成出來，經(jīng)過一系列蛋白水解過程產(chǎn)生具有 生物活性的分子，或稱其為成熟區(qū)域。第一次水解去除了由24個氨基酸組成的信號肽，這 個信號肽對于蛋白進(jìn)入分泌旁路是必需的。然后，在位于第240-243位氨基酸的RSRR(精 氨酸-絲氨酸-精氨酸-精氨酸）位點(diǎn)發(fā)生第二次水解，產(chǎn)生一個分子量27, 680道爾頓的 N-端片段(稱為前肽）以及12, 400道爾頓大小的C-端片段。根據(jù)對其它TGF-0成員的了 解，推測前肽對于C-端區(qū)域正確折疊成為半胱氨酸結(jié)構(gòu)具有重要的作用。而C-端片斷是 具有生物活性的部分。它通過二硫鍵連接形成C-端片段二聚體，并且折疊為半胱氨酸結(jié)結(jié) 構(gòu)，繼而發(fā)揮作用。
[0004] 肌肉生長抑制素基因人工敲除的小鼠（McPherronAC等，1997， nature. 387:83-90)，表現(xiàn)出骨骼肌顯著、廣泛的增加，包括胸部、前肢、后肢以及整個身體 被層，單個肌肉重量約為野生型小鼠的二倍。所有被檢的骨骼肌都受到了基因突變的影響 而發(fā)生了增加，并且雄性和雌性增加與其體型和體重按一定比例。對純合突變小鼠肌肉制 備的切片觀察分析則表明這些小鼠既有肌纖維數(shù)量的增多，又有肌纖維的肥大，肌肉量的 增加是肌纖維數(shù)量以及肌纖維大小增加的雙重結(jié)果。
[0005] 根據(jù)MSTN的生物學(xué)功能，提示對于MSTN基因的敲除可以成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種增 加肌肉的有效策略。通過基因打靶技術(shù)，將該基因失活，是研究其功能和和驗(yàn)證其生產(chǎn)應(yīng)用 價值的理想手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種豬肌肉生長抑制素基因打靶載體及其應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種豬肌肉生長抑制素基因打靶載體，該載體依 次含有至少8.7kb的豬肌肉生長抑制素基因同源左臂、兩端含LoxP位點(diǎn)的正篩選標(biāo)記、至 少1.6kb的豬肌肉生長抑制素基因同源右臂，以及負(fù)篩選標(biāo)記。
[0008] 所述豬肌肉生長抑制素基因同源左臂的核苷酸序列含有至少4. 6kb的豬肌肉生 長抑制素基因外顯子1上游序列、全部外顯子1序列、全部內(nèi)含子1序列、全部外顯子2序 列、以及至少1.6kb的內(nèi)含子2序列，所述豬肌肉生長抑制素基因同源右臂的核苷酸序列含 有從豬肌肉生長抑制素基因外顯子3中第312bp至基因下游的至少1. 5kb的DNA序列。
[0009] 所述的基因打靶載體，正篩選標(biāo)記插入豬肌肉生長抑制素基因的位點(diǎn)為豬肌肉生 長抑制素基因外顯子區(qū)域。
[0010] 所述的基因打靶載體，正篩選標(biāo)記為新霉素素抗性基因。
[0011] 所述的基因打靶載體，負(fù)篩選標(biāo)記為白喉毒素A基因。
[0012] 本發(fā)明還提供一種肌肉生長抑制素基因敲除的豬細(xì)胞系，將根據(jù)上述方法所述基 因打靶載體轉(zhuǎn)染到與打靶載體同源臂DNA來源相同的豬細(xì)胞系中，獲得經(jīng)鑒定為肌肉生長 抑制素基因敲除的豬細(xì)胞系。
[0013] 本發(fā)明還提供一種制備肌肉生長抑制素基因敲除的豬克隆胚胎的方法，將根據(jù)上 述方法所述基因打靶載體轉(zhuǎn)染到與打靶載體同源臂DNA來源相同的細(xì)胞系中，獲得豬肌肉 生長抑制素基因敲除的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，以所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì) 胞為核移植受體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
[0014] 其中，所述與打靶載體同源臂DNA來源相同的細(xì)胞系為豬成纖維細(xì)胞系、豬輸卵 管上皮細(xì)胞系、豬卵巢上皮細(xì)胞系、豬顆粒細(xì)胞系等。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備肌肉生長抑制素基因敲除家畜的方法，其是將根據(jù)上 述方法制備的克隆胚胎通過非手術(shù)法移入家畜子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得基因敲除家畜。
[0016] 本發(fā)明提供的豬肌肉生長抑制素基因打靶載體以及基于該打靶載體建立的肌肉 生長抑制素基因敲除豬的生產(chǎn)方法，肌肉生長抑制素基因敲除豬的肌肉生長量明顯提高， 具有較大的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中豬肌肉生長抑制素基因打靶載體構(gòu)建過程。
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中豬肌肉生長抑制素基因打靶載體pPNLPD-MSTNl結(jié)構(gòu)框 架圖，含有9. 9kb的MSTN基因同源左臂、兩端含LoxP位點(diǎn)的正篩選標(biāo)記基因、2. 6kb的MSTN 基因同源右臂和負(fù)篩選標(biāo)記的基因表達(dá)框。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0020] 實(shí)施例1MSTN基因打靶載體的構(gòu)建
[0021] 構(gòu)建MSTN基因打靶載體的步驟，包括以目標(biāo)生物基因組為模板，PCR擴(kuò)增MSTN基 因同源左臂和同源右臂，用含LoxP位點(diǎn)的標(biāo)記基因?qū)⑼醋蟊酆陀冶圻B接，即構(gòu)建成基因 打靶載體。MSTN基因打靶載體主要包括9. 9kb的MSTN基因同源左臂、兩端含LoxP位點(diǎn)的 正篩選標(biāo)記基因、2. 6kb的MSTN基因同源右臂和負(fù)篩選標(biāo)記。正篩選標(biāo)記基因如新霉素抗 性基因（NE0)等，負(fù)篩選標(biāo)記基因如白喉毒素A基因（diphtheriatoxinA，DTA)等，具體 構(gòu)建過程如下：
[0022] 取生產(chǎn)性能測定優(yōu)良的種豬耳組織，采用組織塊接種法建立豬成纖維細(xì)胞系，細(xì) 胞系命名為DLK001，常規(guī)細(xì)胞傳代以及冷凍保存。細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及冷凍保存方法詳見《精 編細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（J.S.博尼費(fèi)斯農(nóng)等著，章靜波等譯，2007年，科學(xué)出版社)。建立 成纖維細(xì)胞系也可以采用長白豬、大白豬等其它品種的豬組織進(jìn)行培養(yǎng)獲得，也可選用其 它類型細(xì)胞系，如輸卵管上皮細(xì)胞、卵巢上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等。
[0023] 同源左臂（ZB)擴(kuò)增：利用已公布的豬基因組序列（GenBank:麗_003612282)，設(shè) 計(jì)同源左臂，ZB-F:5'-TATCCGC/GGCAATCAGAATAGGAATGGGAACTT-3'，下劃線部分 為SacII限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)；ZB-R:5'-TATGC/GGCCGCACGTAACAGTTTGAGAAGGT AGT-3'，下劃線部分為NotI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。提取上述成纖維細(xì)胞系DLK001基 因組DNA，以該基因組DNA為模板進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增，同源左臂1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 9961bp，包含了MSTN基因外顯子1上游5798bp、外顯子1、內(nèi)含子1、外顯子2、內(nèi)含子2中 1608bp的片段序列。同時按照上述方法，擴(kuò)增了同源左臂2,其長度為8678bp，含MSTN基因 外顯子1上游4515bp、外顯子1、內(nèi)含子1、外顯子2、內(nèi)含子2中1608bp的片段序列。
[0024]同源右臂（YB)擴(kuò)增引物分別為：YB-F:5'-TATG/CTAGCCAGACAGGGTACTCTCAA CAATAG-3'，下劃線部分為NheI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)；YB-R: 5'-TATG/TCGACTGCAAC TCAGTAGCCTGAAAAGTT-3'，下劃線部分為SalI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物長 度為2635bp，包含了從外顯子3中312bp至基因下游2323bp的序列，為同源右臂1。同時 按照上述方法，擴(kuò)增了同源右臂2,其長度為1495bp，包含了從外顯子3中312bp至基因下 游