專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及遺傳學(xué)前沿領(lǐng)域，是一種通過(guò)對(duì)來(lái)源于λ噬菌體的Gateway重組反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行創(chuàng)造性改造，而發(fā)明的一種快速、靈活、便捷的構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法。
二、技術(shù)背景人類(lèi)基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，既是近數(shù)十年來(lái)生物學(xué)領(lǐng)域中的巨大成果，也給生物工作者提出了新的挑戰(zhàn)。由于基因組序列并不能直接演繹出基因組編碼的RNA和蛋白質(zhì)是如何相互整合來(lái)執(zhí)行細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等功能，以致形成整個(gè)人體的形態(tài)、生理和行為的，后基因組時(shí)代的主要任務(wù)既是研究和闡明數(shù)以萬(wàn)計(jì)基因的功能。然而由于人類(lèi)生理和病理過(guò)程的復(fù)雜性，以人體作為試驗(yàn)研究對(duì)象受到了嚴(yán)格的限制。作為哺乳動(dòng)物的小鼠，其基因總數(shù)、基因組結(jié)構(gòu)和生理組織與人類(lèi)極其相似，兩個(gè)物種的染色體有大于99％的同源性，加之在小鼠生理、病理、藥理、毒理、感染、免疫、行為和認(rèn)知方面積累的大量實(shí)驗(yàn)資料，使得小鼠成為詮釋人類(lèi)基因組的結(jié)構(gòu)和功能及生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域中最具科學(xué)價(jià)值的生物。轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因打靶是小鼠遺傳學(xué)研究中最為常用的手段。自從1987年美國(guó)Utah大學(xué)的Mario Capecchi構(gòu)建了第一只基因敲除小鼠以來(lái)，人們已經(jīng)在世界范圍內(nèi)構(gòu)建了3000余種不同類(lèi)型的基因敲除小鼠。在我國(guó)，這項(xiàng)技術(shù)也業(yè)已成熟和完善起來(lái)，成為生物學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)舉足輕重的研究熱點(diǎn)。為了避免某些重要基因在缺失后造成生物胚胎期死亡的限制，人們還發(fā)明了利用Cre-loxP重組酶系統(tǒng)所構(gòu)建的條件基因敲除的方法，即只在特定的時(shí)間或特定的組織中讓目的基因滅活。這極大的擴(kuò)展了基因敲除技術(shù)的應(yīng)用。
構(gòu)建基因敲除的首要工作也是最關(guān)鍵的一步是要構(gòu)建一個(gè)合理、高效的、用于改造胚胎干細(xì)胞基因組DNA的同源重組載體，載體構(gòu)建的質(zhì)量直接決定了最終實(shí)驗(yàn)的成敗。一個(gè)典型的條件基因敲除載體通常由五部分組成(1)5’和3’同源臂，即與靶基因兩端基因組DNA完全相同的序列，用于提供發(fā)生同源重組的位點(diǎn)；(2)NEO正篩選元件，用于選取發(fā)生了重組的干細(xì)胞陽(yáng)性克??；(3)TK負(fù)篩選元件，用于拚棄發(fā)生隨機(jī)插入的干細(xì)胞假陽(yáng)性克?。?4)需要條件敲除的基因片段；(5)位于該片段兩端兩個(gè)同方向排列的Cre重組酶特異識(shí)別位點(diǎn)loxP(如圖1)。對(duì)于以上五部分的拼裝，以往的傳統(tǒng)方法主要依賴(lài)不同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行各片段的切割再連接的經(jīng)典方案。如果實(shí)驗(yàn)進(jìn)展順利，一個(gè)條件基因敲除載體的構(gòu)建往往花費(fèi)3～6個(gè)月時(shí)間。但傳統(tǒng)方法的限制并不僅局限在時(shí)間上，更重要的是，需要敲除的目的基因兩端的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)具有很大的偶然性，而各部分又不可使用相同的內(nèi)切酶，從而使得在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)可供選擇的余地極小，這不僅增加了實(shí)驗(yàn)的難度，還限制了基因敲除的靈活性，更難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期效果。另一方面，在傳統(tǒng)方法對(duì)同源臂的獲取上采用BAC篩選的方法，這不僅費(fèi)時(shí)(約1個(gè)月)、費(fèi)力、費(fèi)錢(qián)(約2000～4000美元)，其中放射性同位素的使用也對(duì)工作者的健康造成極大的危害?？偵纤龅倪@些，都很大程度上延緩了對(duì)基因功能的研究。世界各地的科學(xué)家們也一直努力探索著其中的捷徑。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的針對(duì)傳統(tǒng)方法的諸多局限，為使基因敲除載體的構(gòu)建更加迅速、便捷、靈活、安全，我們借助非常成熟的Gateway同源重組技術(shù)發(fā)明了一種構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法。。
2、技術(shù)方案這種快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法，其特征在于該方法的步驟如下(A)5’和3’同源臂載體的構(gòu)建(如圖2，3)利用特殊設(shè)計(jì)的PCR引物，以基因組DNA為模板，用LA Taq酶擴(kuò)增用于同源重組的5’和3’同源臂片段；目的PCR片段通過(guò)瓊脂糖凝膠分離并切膠回收后，分別與100～200ng pDONRP4-P1R或pDONRP2R-P3載體混合，在BP Clonase II酶切混合物的作用下進(jìn)行Gateway同源重組反應(yīng)，37℃保溫1小時(shí)后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，序列的正確性用M13F、M13R引物正反測(cè)序驗(yàn)證，裝配好的載體我們分別命名為pENTR5’和pENTR3’；(B)中間載體的構(gòu)建(如圖4)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)我們構(gòu)建的質(zhì)粒載體pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT進(jìn)行改造，(1)常規(guī)基因敲除不必做任何改造；(2)條件基因敲除或基因插入將需要敲除或插入的片段用限制性?xún)?nèi)切酶消化，然后用T4連接酶連接至pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT載體中位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的多克隆位點(diǎn)(Multi Cloning Site，MCS)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌后于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)；(C)最終載體的拼裝(如圖5)將以上3種載體與pDEST-R4R3-TK載體各60~100ng相互混合，加入LR Clonase Plus酶切混合物進(jìn)行Gateway同源重組反應(yīng)，37℃保溫1小時(shí)后轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌后于氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，對(duì)長(zhǎng)出來(lái)的克隆進(jìn)行擴(kuò)增、純化即可得到最終的重組載體。
上述的方法步驟A中同源臂的構(gòu)建，所述的同源臂片段是用LA Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得；PCR片段是用BR Gateway重組的方法裝入載體；在對(duì)PCR引物的進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)的三個(gè)要求(1)5’同源臂正向引物5’端加attB4序列，反向引物5’端加attB1序列；(2)3’同源臂正向引物5’端加attB2序列，反向引物5’端加attB3序列；(3)引物與模板互補(bǔ)的部分長(zhǎng)度在30~35bp之間，Tm值不小于70℃，引物以堿基G或C結(jié)尾。
上述的方法步驟B中中間載體的構(gòu)建，其特征在于中間模板載體pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT的使用；上述的方法步驟C中最終載體的拼接，其特征在于pDEST-R4R3-TK載體的使用。
上述方法步驟A和B中所述的LB固體培養(yǎng)基按《分子克隆》配制。
上述的這種方法，主要用于小鼠及其它模式動(dòng)物中的基因敲除、基于Cre/loxP系統(tǒng)的條件基因敲除或基因插入載體的構(gòu)建。
3、有益效果使用本方法進(jìn)行載體構(gòu)建，與傳統(tǒng)方法相比有以下幾大優(yōu)點(diǎn)(1)省時(shí)，可以將原本至少3～6月的工作時(shí)間縮短至1個(gè)月之內(nèi)；(2)高效，由于空載的pDONRP4-P1R、pDONRP2R-P3和pDEST R4R3 TK載體的重組位點(diǎn)之間裝了ccdB自殺元件，極大的減少了假陽(yáng)性克隆的產(chǎn)生；(3)靈活，采用PCR直接擴(kuò)增同源臂的方法，避開(kāi)了限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的困擾，理論上可以作用于基因組DNA的任何一段區(qū)間。經(jīng)我們多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這樣擴(kuò)增的同源臂有可靠的保真性。(4)便捷，我們創(chuàng)造性構(gòu)建的質(zhì)粒pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT、pDEST-R4R3-TK大大的簡(jiǎn)化了各部分拼裝的步驟。
四

圖1是外源構(gòu)建的條件基因敲除載體與內(nèi)源基因組DNA同源重組原理圖。
圖2是5’同源臂與pDONRP4-P1R載體的同源重組圖。
圖3是3’同源臂與pDONRP2R-P3載體的同源重組圖。
圖4是中間載體的構(gòu)建示意圖。
圖5是各片段通過(guò)LR重組反應(yīng)進(jìn)行最終拼接的示意圖。
五具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明(A)5’和3’同源臂載體的構(gòu)建(如圖2，3)該方法是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得5’和3’同源臂PCR引物按照以下方案設(shè)計(jì)對(duì)于5’同源臂，正向引物5’-GGGG-ACAACTTTGTATA-GAAAAGTTG-(模板特異序列)-3’；反向引物5’-GGGG-ACTGCTTTTTTG-TACAAACTTG-(模板特異序列)-3’；對(duì)于3’同源臂，正向引物5’-GGGG-ACAGCTTTCTTGTACAAAGTGG-(模板特異序列)-3’；反向引物5’-GGGG-ACAACTTTGTATAATAAAGTTG-(模板特異序列)-3’，其中模板特異序列除了人工設(shè)計(jì)外，也可以用軟件完成，比如Primer3；PCR反應(yīng)以129系小鼠基因組DNA為模板，在LA Taq體系中完成，推薦的程序?yàn)?4℃ 5min；94℃ 30sec，68℃7min，40循環(huán)；68℃ 10min。經(jīng)我們多次實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)引物長(zhǎng)度在30～35bp，Tm值大于70℃時(shí)，LA Taq可以很好的對(duì)基因組DNA長(zhǎng)片段(1～5Kb)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物質(zhì)量完全可以滿(mǎn)足同源臂的需要；將擴(kuò)增好的片段于瓊脂糖凝膠上分離后純化，即可與pDONR載體進(jìn)行BR重組反應(yīng)，將純化的PCR 1ul與100～200ng相應(yīng)的pDONR載體混合，加入去離子水至8ul，然后加入2ul BP Clonase II酶混合物，混勻，將以上反應(yīng)體系置于37℃保溫1小時(shí)后，5’PCR的attB4和attB1會(huì)在BR重組酶的作用下識(shí)別pDONRP4-P1R上的attP4和attP1R位點(diǎn)，從而使5’同源臂替換出載體上的ccdB元件，同理，3’PCR兩端的attB2和attB3也會(huì)識(shí)別pDONRP2RP3上的attP2R和attP3位點(diǎn)，如圖2，3所示，加入1ul蛋白酶K溶液(2ug/ul)37℃保溫10分鐘使重組酶失活，將10ul溶液全部轉(zhuǎn)化到100ul DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后將大腸桿菌鋪到卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)夜篩選培養(yǎng)，從長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆中抽取的質(zhì)粒，可以用M13F和M13R常規(guī)引物進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性，去除含突變位點(diǎn)的克?。?B)中間載體的構(gòu)建(如圖4)當(dāng)實(shí)驗(yàn)涉及條件基因敲除或基因插入的時(shí)候，我們還需要對(duì)中間載體進(jìn)行改造。這步改造由于采用了pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT而變得異常簡(jiǎn)單，我們只需要將計(jì)劃敲除或插入的片段用限制性?xún)?nèi)切酶的常規(guī)方法接入載體的多克隆位點(diǎn)即可。如圖4所示，在這一載體中，MCS被ccdB元件一分為二，極大的提高了克隆的效率，降低了假陽(yáng)性的產(chǎn)生。MCS兩端我們預(yù)加了兩個(gè)同方向的loxP位點(diǎn)，使用于Cre-loxP體系的使用。在第二個(gè)loxP之后，我們預(yù)加含F(xiàn)RT重組識(shí)別位電的NEO元件，這既滿(mǎn)足了篩選的需要，也便于后續(xù)工作中利用Flp-FRT系統(tǒng)去除NEO對(duì)小鼠染色體的影響。在克隆過(guò)程中，我們推薦兩種方案，一是直接利用BamHI內(nèi)切酶直接切掉ccdB，用BglII或BamHI將目的片段接入載體，其缺點(diǎn)是之后需要一步方向的驗(yàn)證；二是使用SalI和NotI的雙酶切體系，一方面直接確定了接入的方向，另一方面SalI和NotI均屬于基因組中幾率較低的酶種；(C)最終載體的拼裝(如圖5)在最后一步的組裝過(guò)程中，我們只需要將上述三種載體與pDEST-R4R3-TK載體各80mg混合反應(yīng)即可，如圖5所示，在LR ClonaseII酶的作用下，attL4與attR4、attR1與attL1、attR2與attL2、attL3與attR3將分別發(fā)生重組反應(yīng)，從而把四部分順序的連接起來(lái)，在這一反應(yīng)中，混合載體pENTR5’、pENTR3’、pDONR loxP/Target/loxP FRT/NEO/FRT、pDEST R4R3TK各60～100ng，加去離子水至12ul，然后加入4ul 5x反應(yīng)緩沖液，4ul LR Clonase Plus酶混合物，混勻后于37℃保溫1小時(shí)，或置于室溫(25℃)過(guò)夜，反應(yīng)后加入2ul蛋白酶K于37℃保溫10分鐘滅活，反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后將細(xì)菌鋪到氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)夜篩選培養(yǎng)，選取陽(yáng)性克隆檢驗(yàn)即可得到最終的重組載體。
材料與來(lái)源試劑PCR引物由IDT公司合成；LA Taq購(gòu)于Takara生物公司；載體pDONRP4P1R、pDONRP2RP3、BP Clonase II mix(cat No.11789-020)、LRClonase Plus mix(cat.No.12538-013)均購(gòu)于Invitrogen公司；限制性?xún)?nèi)切酶SalI、NotI購(gòu)于New England生物公司、LB固體培養(yǎng)基按《分子克隆》配制。
我們已經(jīng)用四個(gè)不同的基因驗(yàn)證了這一方法的可靠性?，F(xiàn)舉一例如下實(shí)施例1 HRPT2條件基因敲除小鼠的載體構(gòu)建HRPT2是最近幾年發(fā)現(xiàn)和克隆的抑癌基因，它編碼的蛋白叫做Parafibromin。HRPT2基因突變?cè)谌祟?lèi)中會(huì)導(dǎo)致甲狀旁腺瘤綜合癥。但該基因的生理功能目前并不清楚。構(gòu)建HRPT2條件敲除小鼠正是研究其正常生理功能的有效手段。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，我們準(zhǔn)備將該基因的第二個(gè)外現(xiàn)子敲除，以造成基因翻譯時(shí)的移框而導(dǎo)致編碼的蛋白無(wú)效。在這一實(shí)驗(yàn)中，5’同源臂、3’同源臂、以及二號(hào)外現(xiàn)子均用PCR擴(kuò)增的方法獲得。引物如下5’同源臂正向引物5′-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCAGTACAACATCCAGAAG-AAGGAGA-3′，反向引物5′-GGGG-ACTGCTTTTTTGTACAAACTTGGT-GCTTGAGATCAACTGCAGAGAC-3′。3’同源臂正向引物5′-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTAGGATGAGGTTCTTGCACT-GGCAA-3′，反向引物5′-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTCTGGCTTCAGAGAGAC-AGGGAGG-3′。外現(xiàn)子2正向引物5′-GCAGTCGACATACAGTGAGATATGGTGGAGAG-3′，反向引物5′-AGCAGACTGCGGCCGCAATCTCTGTGAAATGAGATACTT-3′。外現(xiàn)子片段用SalI和NotI雙酶切后裝入中間載體的SalI和NotI位點(diǎn)。最終載體完后，我們用AclI進(jìn)行線(xiàn)性化，純化后電轉(zhuǎn)入129/SVJ小鼠胚胎干細(xì)胞。細(xì)胞用G418(250ug/ml)和Ganciclovir(2uM)進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆用Southern雜交的方法進(jìn)行篩選。在300個(gè)細(xì)胞克隆中，我們篩選到了24個(gè)陽(yáng)性，重組率達(dá)8％，是傳統(tǒng)方法1～3％的2.5～8倍。
權(quán)利要求
1.一種快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法，其特征在于該方法的步驟為A.5’和3’同源臂載體的構(gòu)建利用特殊設(shè)計(jì)的PCR引物，以基因組DNA為模板，用LA Taq酶擴(kuò)增用于同源重組的5’和3’同源臂片段，目的PCR片段通過(guò)瓊脂糖凝膠分離并切膠回收后，分別與100-200ng pDONRP4-P1R或pDONRP2R-P3載體混合，在BP Clonase II酶切混合物的作用下進(jìn)行Gateway同源重組反應(yīng)，37℃保溫1小時(shí)后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，序列的正確性用M13F、M13R引物正反測(cè)序驗(yàn)證，裝配好的載體我們分別命名為pENTR5’和pENTR3’；B.中間載體的構(gòu)建根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)我們構(gòu)建的質(zhì)粒載體pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT進(jìn)行改造，(1)常規(guī)基因敲除不必做任何改造；(2)條件基因敲除或基因插入將需要敲除或插入的片段用限制性?xún)?nèi)切酶消化，然后用T4連接酶連接至pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT載體中位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的多克隆位點(diǎn)即MCS，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)；C.最終載體的拼裝將以上3種載體與pDEST-R4R3-TK載體各60-100ng混合，加入LR Clonase Plus酶切混合物進(jìn)行Gateway同源重組反應(yīng)，37℃保溫1小時(shí)后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，對(duì)長(zhǎng)出來(lái)的克隆進(jìn)行擴(kuò)增、純化即可得到最終的重組載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟A中所述的同源臂片段用LATaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得；PCR片段用BR Gateway重組的方法裝入載體；在對(duì)PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)的三個(gè)要求(1)5’同源臂正向引物5’端加attB4序列，反向引物5’端加attB1序列；(2)3’同源臂正向引物5’端加attB2序列，反向引物5’端加attB3序列；(3)引物與模板互補(bǔ)的部分長(zhǎng)度在30-35bp之間，Tm值不小于70℃，引物以堿基G或C結(jié)尾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟B中中間模板載體pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT的使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟C中pDEST-R4R3-TK載體的使用。
5.權(quán)利要求1所述的一種快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法在小鼠及其它模式動(dòng)物的基因敲除、基于Cre/loxP系統(tǒng)的條件基因敲除或基因插入載體構(gòu)建中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種借助于Gateway克隆系統(tǒng)的快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法。首先，它用特殊設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到用于同源重組的5’和3’同源臂，通過(guò)BP重組反應(yīng)分別裝入pDONRP4－P1R和pDONRP2R－P3載體中；然后，將目的片段裝入我們創(chuàng)造性構(gòu)建的中間載體pDONR loxP/MCS/loxP－FRT/NEO/FRT中；最后，將以上3種載體與pDEST R4－R3TK載體的混合物在通過(guò)1小時(shí)快速LR重組反應(yīng)后，5’同源臂，中間片段，3’同源臂，以及TK負(fù)篩選元件便會(huì)自動(dòng)按照設(shè)計(jì)的順序拼接，轉(zhuǎn)化并純化后即得到基因打靶用載體。該方法具有快速、靈活、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn)，并突破了傳統(tǒng)方法中內(nèi)切酶位點(diǎn)分布的限制，在基因功能研究方面有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1844401SQ20061003783
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者孔冬, 高翔, 王鵬飛, 章念, 鄭斌 申請(qǐng)人:南京大學(xué)