專利名稱：水稻米香基因、包含水稻米香基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是水稻育種基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
由于香味是優(yōu)質(zhì)稻米重要特征之一，在世界范圍內(nèi)開展了廣泛的研究。已將控制米香的基因定位在水稻第8號(hào)染色體上，位于分子標(biāo)記RM515和SSRJ07約386kb范圍內(nèi)。通過對(duì)這一區(qū)域的基因進(jìn)行測(cè)序，Bradbury等人(2005)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在米香與非香品種間存在序列差異的基因，這一基因編碼三甲基甘氨醛脫氫酶(Beitaine Aldehyde dehydrogenase)，推測(cè)可能與米香的合成有關(guān)。這是目前能見到的有關(guān)米香基因最新報(bào)道，作者只是推測(cè)這一基因可能與米香有關(guān)，但是還沒有最關(guān)鍵的功能互補(bǔ)證據(jù)，也就是說迄今為止還沒有克隆到控制米香的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)米香基因研究的現(xiàn)狀，克隆了控制水稻米香的基因，發(fā)明了包含水稻米香基因的表達(dá)載體，為培育具有米香特性的優(yōu)質(zhì)水稻提供條件。
本發(fā)明之米香基因的核苷酸總長(zhǎng)為9066個(gè)堿基，包括起始密碼子ATG上游1242堿基，基因區(qū)域5859堿基和終止密碼子TAA下游1965堿基，編碼區(qū)由15個(gè)外顯子組成，其基因序列為發(fā)生改變的編碼三甲基甘氨醛脫氫酶基因Badh，同正常的Badh基因相比第7外顯子發(fā)生一個(gè)8堿基的缺失。
本發(fā)明在精細(xì)定位、功能互補(bǔ)的基礎(chǔ)上，首先克隆出了與稻米香味有關(guān)的基因，米香基因?yàn)榫幋a功能缺陷的三甲基甘氨醛脫氫酶，而非香基因編碼正常的三甲基甘氨醛脫氫酶。在序列比對(duì)的基礎(chǔ)上獲得了米香基因特異的分子標(biāo)記。隨著人們生活水平的提高，對(duì)稻米的品質(zhì)提出了更高的要求。米香基因的克隆和相關(guān)基因標(biāo)簽標(biāo)記的發(fā)展可以使人們利用遺傳手段或分子標(biāo)記輔助選擇來改良水稻品質(zhì)，在水稻育種單位將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。用基因標(biāo)簽分子標(biāo)記在育種過程中檢測(cè)各個(gè)單株的米香基因，選育帶米香性狀的各種優(yōu)質(zhì)品種。因?yàn)槊紫阈誀顪?zhǔn)確測(cè)定非常困難，在育種上過程中很容易被丟失，用分子標(biāo)記輔助選擇的方法是最簡(jiǎn)單、可靠的直接培育優(yōu)良品種的方法。米香是一種非常誘人的香味物質(zhì)，克隆到米香基因后可以通過生物反應(yīng)器的方法來大量合成米香物質(zhì)，這在工業(yè)生產(chǎn)米香物質(zhì)會(huì)得到廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了控制米香性狀表達(dá)的水稻米香基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
用米香型水稻Badh基因二側(cè)的限制性酶切位點(diǎn)HindIII，將完整的水稻米香基因從陽性BAC克隆中切割下來，再克隆到已知的表達(dá)載體pCAMBIA1302中，獲得水稻米香基因表達(dá)載體。
本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)明目的還在于提出了上述表達(dá)水稻米香基因載體的用途。
用于優(yōu)良水稻品種的培育。
可用米香基因序列構(gòu)建RNA干擾載體轉(zhuǎn)化正常水稻，培育香稻品種。
獲得控制米香基因后，可以利用已知的米香基因序列構(gòu)建RNA干擾載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化將優(yōu)良水稻品種內(nèi)源的編碼三甲基甘氨醛脫氫酶基因失活，快速培育優(yōu)質(zhì)香稻品種。
具體實(shí)施例方式
按照本發(fā)明的技術(shù)方法可實(shí)現(xiàn)米香等目標(biāo)基因的克隆，并將克隆到的基因應(yīng)用到育種等領(lǐng)域上。
1、基因的精細(xì)定位用目標(biāo)性狀(如米香性狀)表現(xiàn)差異的秈粳稻雜交，組配F2、F3、BC1等分離后代群體。利用水稻基因組上的SSR分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定位。在定位的基因區(qū)域根據(jù)秈粳稻基因組序列的差異發(fā)展高密度分子標(biāo)記，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精細(xì)定位。本研究中共組配8個(gè)分離后代群體，共計(jì)2891個(gè)單株，通過定位確定米香基因所在區(qū)域，在米香基因區(qū)域根據(jù)秈粳稻的序列發(fā)展出了平均物理距離只有30kb的高密度分子標(biāo)記，最終將米香基因定位在第8號(hào)染色體分子標(biāo)記L02和L06所限定的69kb范圍內(nèi)。另外，對(duì)于米香這類測(cè)定非常困難的性狀需要對(duì)關(guān)鍵重組個(gè)體進(jìn)行自交，對(duì)自交后代的基因型和表現(xiàn)型進(jìn)行詳細(xì)測(cè)定，以確保定位的準(zhǔn)確性。在米香基因的定位中，對(duì)關(guān)鍵重組個(gè)體進(jìn)行自交，用米香基因區(qū)域的分子標(biāo)記分析自交后代的基因型，用高精度GC-MS法直接測(cè)定2AP的含量來確定相應(yīng)的表現(xiàn)型。此項(xiàng)驗(yàn)證確保了基因定位的準(zhǔn)確性，在類似米香這樣復(fù)雜性狀的基因克隆中必不可少。
2、定位區(qū)域候選基因的確定水稻中克隆基因的最大優(yōu)勢(shì)在于人們已經(jīng)獲得了秈粳稻基因組的全序列，并預(yù)測(cè)了各種可能的基因，這些信息可以在互聯(lián)網(wǎng)上隨時(shí)查詢。在獲得了目標(biāo)基因的精細(xì)位置后就很容易獲得相應(yīng)區(qū)域的候選基因。本發(fā)明在確定了米香基因位置后，我們查到了這一區(qū)域內(nèi)秈粳稻的序列信息，通過相互比較分析確定了三個(gè)米香的候選基因，分別控制真核類碳酸酐酶(Eukaryotic-type carbonic anhydrase)、3-甲基丁酰輔酶A羧化酶，β鏈(3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase，beta chain)和三甲基甘氨醛脫氫酶(Betaine aldehyde dehydrogenase)。
3、表達(dá)載體的構(gòu)建候選基因確定后，需要將它們克隆到表達(dá)載體中用于基因功能互補(bǔ)鑒定。候選基因分離最好從基因組BAC庫(kù)中分離，這樣可以確保基因的完整性。另外，也可以通過長(zhǎng)距離PCR的方法獲得，這樣在PCR過程中可能會(huì)產(chǎn)生堿基錯(cuò)配，影響鑒定結(jié)果。表達(dá)載體可分為基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，在水稻上一般都采用農(nóng)桿菌表達(dá)載體，這類載體中目前用得比較多的是pCAMBIA系列載體。在克隆米香基因時(shí)，分別構(gòu)建香米品種蘇御糯和非香品種南京11基因組大片段BAC庫(kù)。利用緊密連鎖和共分離的分子標(biāo)記分別從二個(gè)BAC庫(kù)中獲得了4個(gè)和2個(gè)覆蓋候選基因區(qū)域的陽性BAC克隆。通過亞克隆方法將蘇御糯BAC克隆中的三個(gè)米香候選基因以及南京11BAC克隆中的三個(gè)非香候選基因分別克隆到表達(dá)載體pCAMBIA1302中。這一方法最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是根據(jù)已測(cè)序的水稻秈粳亞種基因組序列選定候選基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)，通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將候選基因直接從陽性BAC克隆中切割下來，并克隆到表達(dá)載體中。最后將克隆到的候選基因測(cè)序，獲得全長(zhǎng)序列。
4、轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)鑒定從候選基因中確定哪個(gè)是真正的基因必須通過轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)鑒定，也就是將克隆到表達(dá)載體中的候選基因通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入到性狀為隱性的受體中，如在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出顯性的性狀，對(duì)應(yīng)的候選基因就是我們所要克隆的基因?？紤]到非香對(duì)香為顯性，將三個(gè)來自于南京11的非香候選基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入到香米品種蘇御糯和武香粳中。米香性狀測(cè)定表明，導(dǎo)入了編碼三甲基甘氨醛脫氫酶的轉(zhuǎn)基因植株失去了米香特征，此互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果表明三甲基甘氨醛脫氫酶與米香性狀有關(guān)。對(duì)此基因的序列分析后表明，在非香品種中編碼三甲基甘氨醛脫氫酶的基因正常，而在香米品種蘇御糯及其他米香品種中此基因在編碼區(qū)的第七外顯子區(qū)域出現(xiàn)8個(gè)堿基的缺失和3個(gè)堿基的變異，翻譯提前終止，產(chǎn)生截短的蛋白。至此，轉(zhuǎn)化鑒定結(jié)合序列分析最終確定了序列發(fā)生變異的編碼三甲基甘氨醛脫氫酶的基因是控制米香的基因。
米香基因是序列發(fā)生變異的Badh基因，其核苷酸序列包括起始密碼子ATG上游1242堿基，基因區(qū)域5859堿基和終止密碼子TAA下游1965堿基，總長(zhǎng)為9066個(gè)堿基，編碼區(qū)由15個(gè)外顯子組成。與正常的Badh基因序列相比最顯著的特征是第7外顯子發(fā)生一個(gè)8堿基的缺失。如

圖1所示。
5、基因標(biāo)簽標(biāo)記的發(fā)展克隆到基因后可根據(jù)基因序列發(fā)展基因標(biāo)簽分子標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助育種。在實(shí)際應(yīng)用中這種標(biāo)記非常實(shí)用，可大大提高常規(guī)育種的效率?？寺〉矫紫慊蚝?，發(fā)展基因特異的標(biāo)簽標(biāo)記，這一標(biāo)記的引物序列為左引物5′-GTTGGTCTTCCTTCAGGTGT-3′；右引物5′-CATAGCAAGTGGCATGTACC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物香米中為508bp；非香水稻中為516bp。這一標(biāo)記可在分離后代中直接顯示帶有米香基因的個(gè)體，從而選育帶米香性狀的優(yōu)良水稻品種。
6、獲得控制米香基因后，可以利用米香基因序列構(gòu)建RNA干擾載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化正常水稻，將正常水稻品種內(nèi)源的編碼三甲基甘氨醛脫氫酶基因失活，快速培育優(yōu)質(zhì)香稻品種。
序列表aagcttctct agatacgttt ccatcaaacg aagcccacgg tcaattggtt aacccagcaa 60gcctccatat atgacgtcgg gagtttgact gcgatataac ggtaaaataa tttaaaggtt120tttaccgttc aatagtcaaa atccctaccg tctctcctcc aacatgctct ttcgtttcat180aaaaatcacc acagcaactg aatattgata tgtatattct aatattccct ccatcctaaa240atatagcaac cttatatctt atactggata ggatatatct atatccagat taattgaatt300atgatttgtc tcatctagta aaatgttgct agtatatttt atgacgaagg gagtactata360aatttaaata tattaatatt tagtattaaa ttgatttttt atgaggagga tacagtaggc420tataagccag ctgcaaacat attttaagaa gataaatgag gagagagaag agcagcgggc480tatagatttg tagccacctg tagcacggac ttcaagacgc agtgcgtatg ataagtggga540ccatgtattg atagtgtagt atgtaactat cttcctccgt ttcacaatgt aagtcattct600agcatttctc atattcatat taatgttaat gaatctagac ttatattgta aaacggagga660agtatatgaa tgagctatta gattggctct agatggatta gagctattag ttggctatac720tactccctcc tttcctaaat atttgacgcc gttgactttt ttaaacatgt ttgactgttc780gtcttattta aaaaactttt gtgaaatgtg taaaactata tgtatacata aaagtatatt840taacaataaa tcaaatgata aaaaaaaatt aataattact taaaattttt taaataagat900gaacggtcaa atatttttta aaaaaatcaa cggcgtaaac ttctctggaa aactactccg960aagtccgtac caactgcccg cgactcccgc tgcaacgtgc gctccgtggg aagaggaaaa 1020gatagaaaga tacctatcgc tttccacctc aacgctccac tccaccacca ccgcgcccgc 1080gccgcaaggc agcacagaac agagcactcc ctctcccacc accactccac acctgacacc 1140acgcgggctg cctccatcgt catcgatcca tctccgtatc tctcaccgac cccaaatcgc 1200acagctccag ctcctcctcg atccccgtcg cgatcggcga gatggccacg gcgatcccgc 1260agcggcagct cttcgtcgcc ggcgagtggc gcgcccccgc gctcggccgc cgcctccccg 1320tcgtcaaccc cgccaccgag tcccccatcg gtaccctcct cttcaccctc tccaccctct 1380gcttctgcct ctgattagcc tttttgttgt tgttgttgtt gctgctgttt tttgcgtgtc 1440ggtgcgcagg cgagatcccg gcgggcacgg cggaggacgt ggacgcggcg gtggcggcgg 1500cgcgggaggc gctgaagagg aaccggggcc gcgactgggc gcgcgcgccg ggcgccgtcc 1560gggccaagta cctccgcgca atcgcggcca aggtagggtg gtgactaccc ccaccccccc 1620cccccccccc aacgcgaccc gcgtgcgtgt gttccgtaca gggggaggag ctccgcgtgg 1680ctctccagta ggtttttgag ccccaaatcg atcgatatgc tctagtttta agtttgctgc 1740ttaaattcct caagggttta gtttgcaacc aaatccttat tttagcttcg gtataagccc 1800cccatatgat gtgcgtgcgt cggcatcgga agtgcgtatc ctctgttctg gactaggaat 1860tggccatagg ttgatcgaca gttcgagtat tctgcttctg tttggaataa gttggaagca 1920tggctgattg tgtatctgga tgctgttttt gtggtgattc gtttcaagct cttgttaatt 1980gatgggttca agcggagagg gtgcgcaaca acaagtgtat atggctcacg gccatgggtg 2040tgcacatttg attggtgcgc aacaacaagt gtatattgtg tgtgcttcgt tagttggcag 2100gtcctagtca ctaaatcact attggattgg tactagctac ttttgtgcct tgacgatggg 2160actggattac tagccttttg gttgcctttg tggtattccg ttgttatggg cctgttgatg 2220gatggatccc tttaatttct agtgccaaat gcatgctaga tttctcacag tttttctctt 2280caggttatat ttctcgtatt tccttttcct aaaggattgc tttttcatgt attttctggc 2340atatataggt tattattatt attattctcc agaacaagat tacccatatt atggatcact 2400agtgtacact tttttggatg aaaaacctac ttactgaaag taaaacagtg accagtgcac 2460
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權(quán)利要求
1.水稻米香基因，其特征是其核苷酸總長(zhǎng)為9066個(gè)堿基，包括起始密碼子ATG上游1242堿基，基因區(qū)域5859堿基和終止密碼子TAA下游1965堿基，編碼區(qū)由15個(gè)外顯子組成，其基因序列為發(fā)生改變的編碼三甲基甘氨醛脫氫酶基因Badh，同正常的Badh基因相比第7外顯子發(fā)生一個(gè)8堿基的缺失。
2.一種包含如權(quán)利要求1所述水稻米香基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于用米香型水稻Badh基因二側(cè)的限制性酶切位點(diǎn)HindIII，將完整的水稻米香基因從陽性BAC克隆中切割下來，再克隆到表達(dá)載體pCAMBIA1302中，獲得水稻米香基因表達(dá)載體。
3.一種如權(quán)利要求2所述水稻米香基因表達(dá)載體的用途，其特征在于用于優(yōu)良水稻品種的培育。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述水稻米香基因表達(dá)載體的用途，其特征在于用米香基因序列構(gòu)建RNA干擾載體轉(zhuǎn)化正常水稻，培育香稻品種。
全文摘要
水稻米香基因、包含水稻米香基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法及用途，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是水稻育種基因技術(shù)。水稻米香基因的核苷酸總長(zhǎng)為9066個(gè)堿基，包括起始密碼子ATG上游1242堿基，基因區(qū)域5859堿基和終止密碼子TAA下游1965堿基，編碼區(qū)由15個(gè)外顯子組成，其基因序列為發(fā)生改變的編碼三甲基甘氨醛脫氫酶基因Badh，同正常的Badh基因相比第7外顯子發(fā)生一個(gè)8堿基的缺失。用米香型水稻Badh基因二側(cè)的限制性酶切位點(diǎn)HindIII，將完整的水稻米香基因從陽性BAC克隆中切割下來，再克隆到表達(dá)載體pCAMBIA1302中，獲得水稻米香基因表達(dá)載體，可用于優(yōu)良水稻品種的培育。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1810974SQ20061003770
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日
發(fā)明者徐明良, 陳賽華, 楊毅, 史薇薇, 吳娟 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)