將得到的PCR產物用NcoI和SpeI酶切，得到的酶切產物與經過同樣酶切的 PCAMBIA1304載體（公眾可從中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所獲得）連接，得到連 接產物，將連接產物轉化大腸桿菌，得到轉化子。提取轉化子的質粒，送去測序，結果為該質 粒為將序列表中的SEQ ID No. 1自5'末端第1-435位核苷酸插入pCAMBIA1304的NcoI和 SpeI酶切位點間得到的載體，命名為pCAMBIA1304-Ma0FPl。
[0044] 4、重組菌的獲得
[0045] 將 pCAMBIA1304_Ma0FPl 轉入 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (公眾 可從中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所獲得）中，得到重組菌，提取重組菌的 質粒測序，該質粒為pCAMBIA1304-Ma0FPl，將含有該質粒的重組菌命名為LBA4404/ pCAMBIA1304-Ma0FPl。
[0046] 5、轉MaOFPl番茄的獲得及鑒定
[0047] 1)轉MaOFPl番茄獲得
[0048] 將上述LBA4404/pCAMBIA1304-Ma0FPl侵染野生型番茄的葉片，農桿菌侵染了約 500個葉盤。分化出的芽經過篩選獲得30個抗性芽，最后移栽成活了 15株抗性植株，轉化 效率為3 % ;得到15株TO代轉MaOFPl的番茄。
[0049] 2)轉MaOFPl番茄的鑒定
[0050] 提取TO代轉MaOFPl的番茄進行Southern印跡檢測，以未轉化的 野生型番茄為對照，探針引物為Pl :5 ' -GCCATTAACGGCCCACAGTTC-3 ' ;P2 : 5 ' -TGGTGGAGAGGTGAATTCAAG-3。結果如圖 2 所示，LI、L2、L3、L4、L5、L6、L7 為 TO代轉MaOFPl番茄的不同株系，CK-為未轉化的野生型番茄，為陰性對照，CK+為 pCAMBIAl304-Ma0FP 1質粒，為陽性對照，可以看出，得到4株編號為L3、L5、L6、L7的陽性TO 代轉MaOFPl的番茄。
[0051] 采用同樣的方法將空載體PCAMBIA1304轉入野生型番茄中，得到TO代轉空載體番 茄，按照上述方法進行Southern印跡檢測，未檢測到目的片段，說明得到陽性TO代轉空載 體番爺。
[0052] 將上述TO代植物均播種、收種，直到得到T2代純合株系。
[0053] 實施例2、MaOFPl的功能研究
[0054] 1、轉MaOFPl番茄的表型
[0055] 播種編號為L3、L5、L6、L7的T2代轉MaOFPl番茄（MaOFPl)、T2代轉空載體番茄 和未轉化野生型番茄（對照），將以上株系番茄種子播在育苗缽中，在25°C，光照30001UX， 8h/d下培養(yǎng)，生長2個月左右當植株生長健壯，株高達15-20cm時將幼苗轉入大田，觀察紅 熟期果實。每個株系20株，實驗重復三次，結果取平均值土標準差。
[0056] 結果如圖3所示，其中A為紅熟果實縱切面；B為MaOFPl對紅熟果實重量的調控， C，D為MaOFPl對紅熟果實果皮果肉厚度的調控，E為MaOFPl對紅熟果實可溶性固形物含量 的調控。
[0057] 圖3A中看出，T2代轉MaOFPl番茄植株與野生型番茄相比果實變大，重量增加；統(tǒng) 計果重（果實重量），結果如下（圖3B所示）：編號為L3、L5、L6、L7的4個T2代轉MaOFPl 番茄的單果重分別為（單位：克）：13· 23±0· 26、13· 85±0· 11、11· 68±0· 28、12· 68±0· 15， 而野生型番茄果重9. 37±0. 399克。
[0058] 圖3C中，T2代轉MaOFPl番茄植株與野生型番茄相比果肉增厚統(tǒng)計編號為L3、 L5、L6、L7的4個T2代轉MaOFPl番茄的果肉厚度，結果如下：2. 59±0. 11、2. 80±0. 10、 2. 36±0. 02、2. 49±0. 10,而野生型番茄果肉厚度為2. 18±0. 02。
[0059] 圖3D中，T2代轉MaOFPl番茄植株與野生型番茄相比果皮增薄，統(tǒng)計編號為L3、 L5、L6、L7的4個T2代轉MaOFPl番茄的果皮厚度，結果如下：0. 306±0. 009、0. 372±0. 016、 0. 387±0. 009、0. 382±0. 003,而野生型番茄果皮厚度為 0. 265±0. 013。
[0060] 圖3E中，T2代轉MaOFPl番茄植株與野生型番茄相比紅熟期果實可溶性固形物含 量增加，統(tǒng)計編號為L3、L5、L6、L7的4個T2代轉MaOFPl番茄的可溶性固形物含量，結果 如下：4. 55±0. 048、5. 15±0. 085、5. 75±0. 625、6. 0±0. 42,而野生型番茄紅熟期果實可溶 性固形物為4. 10±0. 17。
[0061] 2、MaOFPl在轉基因株系中的表達
[0062] 分別采集編號為L3、L5、L6、L7的T2代轉MaOFPl番茄紅熟期果實，提取 總 RNA，反轉錄 cDNA 利用 OVRTP I :5 ' -GCCATTAACGGCCCACAGTTC-3 ' ;0VRTP2 : 5，-TGGTGGAGAGGTGAATTCAAG-3，進行 qRT-PCR 檢測 MaOFPl 的表達。內參基因登 錄號為（AK318637)，引物序列為 actinPl :5 ' -CCAACAGAGAGAAGATGA-3 ' actinP2 : 5' -ATGTCTCTTACAATTTCCCG-3'。
[0063] 結果如圖4所示，其中野生型番茄紅熟期果實中基本檢測不到該基因的表達，而 在1^3、1^5、1^6、和1^7株系果實中表達量都較大，分別為 ：9.196、7.948、6.886、8.411。推測它 們對品質形成具有較大的作用。
[0064] 從上述可以看出,MaOFPl對番茄果實品質表現(xiàn)出顯著的調控作用。果實變大，果實 重量增加，果皮果肉厚度增加，果實可溶性固形物含量顯著增加，本研究的研究結果揭示出 MaOFPl基因在對果實品質影響的潛在價值，有可能為今后改良果實品質提供寶貴的基因資 源，同時對果實品質形成機理的研究提供了新的切入點。
【主權項】
1. MaOFPl基因或MaOFPl基因編碼產物MaOFPl蛋白在改良植物果實品質中的應用； 所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表中的SEQ ID No. 1 自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl基因的編碼產物MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序 列表中的SEQ ID No. 2。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于： 所述改良植物果實品質體現(xiàn)在提高植物果實的重量，果皮果肉厚度，果實可溶性固形 物含量； 所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物；所述雙子葉植物進一步具體為番茄； 所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表中的SEQ ID No. 1 自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl基因的編碼產物MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序 列表中的SEQ ID No. 2。
3. -種表達載體，為將MaOFPl基因插入pCAMBIA1304中，得到的表達MaOFPl蛋白的載 體； 所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表中的SEQID No. 1 自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 2。
4. 一種培育轉基因植物方法，為將MaOFPl基因導入目的植物，獲得具有如下1)-4)中 至少一種特征的轉基因植物：1)所述轉基因植物的果實重量大于所述目的植物；2)所述轉 基因植物果實的果肉厚度大于所述目的植物；3)所述轉基因植物果實的果皮厚度大于所 述目的植物；4)所述轉基因植物果實的可溶性固形物含量大于所述目的植物； 所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物；所述雙子葉植物進一步具體為番茄； 所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表中的SEQ ID No. 1 自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl基因的編碼產物MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序 列表中的SEQ ID No. 2。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的改良植物果實品質的基因MaOFP1，同時涉及MaOFP1基因在改良植物果實品質中的相關應用。本發(fā)明提供了一種培育轉基因植物方法，為將MaOFP1基因導入目的植物，獲得具有如下1)-4)中至少一種特征的轉基因植物：1)所述轉基因植物的果實重量大于所述目的植物；2)所述轉基因植物果實的果肉厚度大于所述目的植物；3)所述轉基因植物果實的果皮厚度大于所述目的植物；4)所述轉基因植物果實的可溶性固形物含量大于所述目的植物；所述MaOFP1基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No.1或序列表中的SEQ ID No.1自5’末端第1-435位核苷酸；所述MaOFP1基因的編碼產物MaOFP1蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No.2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明將香蕉果實的MaOFP1基因，導入野生型番茄中，得到品質改良的轉基因植物，為植物育種奠定了基礎。
【IPC分類】C12N15-29, A01H5-08, C07K14-415, C12N15-84
【公開號】CN104611345
【申請?zhí)枴緾N201510059797
【發(fā)明人】金志強, 劉菊華, 徐碧玉, 歐陽婷, 李雅超, 張建斌, 賈彩紅, 王卓, 苗紅霞
【申請人】中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月5日