一種改良植物果實(shí)品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種改良植物果實(shí)品質(zhì)的基因及其編碼產(chǎn)物 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 0FP(ovate family protein, 0FP)(卵形家族蛋白基因）是僅存在于植物中的一 類基因，該類基因編碼的蛋白質(zhì)具有一個擬核定位信號和一個由70個氨基酸組成的未知 功能的保守結(jié)構(gòu)域 Domain ofUnknown Function 623 (DUF623)結(jié)構(gòu)域（Liu 等，2002)，后來 這個結(jié)構(gòu)域又更名為OVATE結(jié)構(gòu)域（Hackbusch等，2005)。OVATE基因最先在番茄中被分離 鑒定為果實(shí)形狀的重要調(diào)控因子，是由OVATE基因在翻譯過程中終止子提前出現(xiàn)而導(dǎo)致番 茄果實(shí)由圓形到梨形的轉(zhuǎn)變（Liu等，2002)。后來，在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了具有保守的OVATE 結(jié)構(gòu)域的AtOFPs基因家族，并且表明其具有調(diào)節(jié)植物次生細(xì)胞壁伸長的作用（Hackbusch 等，2005 ;Pagnussat 等，2007 ;Wang 等 2007 ;2011 ;Li 等 2011)。Tsaballa 等從辣椒中克隆 到一個OVATE基因 CaOvate，其參與決定果實(shí)的形狀。然而，目前對于這一類基因功能的研 究相當(dāng)有限，已有的報(bào)道也僅停留在其對果實(shí)形狀的調(diào)控作用方面，對于其對果實(shí)品質(zhì)的 調(diào)控作用的研究未見報(bào)道。
[0003] 香蕉（Musa acuminata Colla)是世界重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，也是僅次于柑 桔的世界第二大水果，是全球鮮果消費(fèi)量最大的水果之一。隨著香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展和人民生活 水平的提高，對于香蕉品質(zhì)的要求越來越高。果型美觀、營養(yǎng)保健、耐儲保鮮的高品質(zhì)香蕉 成為大眾的需求，品質(zhì)改良也就成為香蕉產(chǎn)業(yè)能否可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵科技問題。然而目前 對香蕉果實(shí)品質(zhì)形成和調(diào)控機(jī)制的研究還很不深入。本研究以香蕉MuMDSl為誘餌，采用 酵母雙雜交技術(shù)從香蕉果實(shí)采后2天的cDNA文庫中釣出了一個ovate family protein，命 名為MaOFPl。推測該基因可能在香蕉果實(shí)品質(zhì)形成過程中具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供MaOFPl基因及其編碼產(chǎn)物。
[0005] 所述MaOFPl的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1 ;
[0006] 所述MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 2。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供MaOFPl基因或MaOFPl基因編碼產(chǎn)物MaOFPl蛋白的 新用途。
[0008] 本發(fā)明提供了 MaOFPl基因或MaOFPl基因的編碼產(chǎn)物MaOFPl蛋白在改良植物果 實(shí)品質(zhì)中的應(yīng)用；
[0009] 所述改良植物果實(shí)品質(zhì)體現(xiàn)在提高植物果實(shí)的可溶性固形物含量，增加果重、增 加果皮果肉厚度；
[0010] 所述植物具體為雙子葉植物或者單子葉植物；所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為番 爺；
[0011] 所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表中的SEQ ID No. 1自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 2 〇
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法。
[0013] 本發(fā)明提供的方法，為將MaOFPl基因?qū)肽康闹参?，獲得具有如下1)-4)中至少 一種特征的轉(zhuǎn)基因植物：
[0014] 1)所述轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)重量大于所述目的植物；
[0015] 2)所述轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)的果肉厚度大于所述目的植物；
[0016] 3)所述轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)的果皮厚度大于所述目的植物；
[0017] 4)所述轉(zhuǎn)基因植物果實(shí)的可溶性固形物含量大于所述目的植物；
[0018] 上述方法中，所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表 中的SEQ ID No. 1自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl基因的編碼產(chǎn)物MaOFPl蛋白 的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 2。
[0019] 上述方法中，所述MaOFPl基因通過表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
[0020] 上述方法中，所述表達(dá)載體為將所述MaOFPl基因插入pCAMBIA1304中，得到的表 達(dá)MaOFPl蛋白的載體；在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體具體為將序列表中的SEQ ID No. 1 自5'末端第1-435位核苷酸插入pCAMBIA1304的NcoI和SpeI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0021] 上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物；所述雙子葉植物具體 為番爺。
[0022] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種表達(dá)載體。
[0023] 本發(fā)明提供的表達(dá)載體，為將MaOFPl基因插入pCAMBIA1304中，得到的表達(dá) MaOFPl蛋白的載體；在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體具體為將序列表中的SEQ ID No. 1自 5'末端第1-435位核苷酸插入pCAMBIA1304的NcoI和SpeI酶切位點(diǎn)間得到的載體。
[0024] 所述MaOFPl基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1或序列表中的SEQ ID No. 1自5'末端第1-435位核苷酸；所述MaOFPl蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 2 〇
[0025] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將MaOFPl導(dǎo)入野生型番茄，獲得35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn) MaOFPl番茄株系，過量表達(dá)MaOFPl增加了植物果實(shí)重量、果肉果皮厚度和可溶性固形物含 量。這些結(jié)果顯示MaOFPl在果實(shí)品質(zhì)形成過程中發(fā)揮著重要作用。
【附圖說明】
[0026] 圖1為MaOFPl在香蕉不同組織的RT-PCR表達(dá)分析
[0027] 圖2為Southern印跡檢測
[0028] 圖3為轉(zhuǎn)MaOFPl番茄果實(shí)品質(zhì)檢測。其中A為紅熟果實(shí)縱切面；B為紅熟果實(shí)重 量檢測；C為紅熟果實(shí)果肉厚度檢測；D紅熟果實(shí)果皮厚度檢測；E為紅熟果實(shí)可溶性固形 物含量檢測。
[0029] 圖4為MaOFPl在轉(zhuǎn)基因株系紅熟果實(shí)中的表達(dá)分析
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 下述實(shí)施例中香蕉（Musa acuminateL. AAA group cv. Brazilian)果實(shí)（開花后 100-120天）從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所澄邁香蕉種植園購買。采自綠熟 期（花后100天）的果實(shí)、花、子房、根、莖和葉于液氮中速凍后_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 番爺（Lycopersivonesculenlum Mill.)為AV6純系，以下簡稱為野生型番爺，購 自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品質(zhì)資源研究所蔬菜中心。種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技 術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地，采集轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)、根、莖、花及葉片液氮速凍后_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 實(shí)施例1、轉(zhuǎn)MaOFPl番茄的獲得
[0035] 1、基因 MaOFP 1的獲得
[0036] 應(yīng)用 Clontech 公司的 MATCHMAKER? GAL4Tw〇-Hybrid System 3 試劑盒，以香 蕉MuMDSl為誘餌，構(gòu)建香蕉果實(shí)采后2天的cDNA文庫，采用共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母AH109， 在SD/-Ade/-Hi S-Leu/-Trp+X-a-gal上篩選，挑取藍(lán)色菌落，提取酵母質(zhì)粒DNA作為模板， 用試劑盒中的長距離 PCR 引物（PI : 5 ^ -CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3 ^ and P2 :5^ -GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3'和 the Advantage 2PCR Polymerase Mix (Clontech，Cat. No. 639201)擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，生物信息學(xué)分析后再設(shè)計(jì) 全長引物，擴(kuò)增得到的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID No. 1，該核苷酸序列所示的基因命 名為MaOFPl，其編碼的蛋白為MaOFPl，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No. 2。
[0037] 2、香蕉MaOFPl表達(dá)分析
[0038] 香蕉根、莖、葉、花、子房和采后0天的香蕉果實(shí)進(jìn)行總RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄。
[0039] 根據(jù)MaOFPl序列在非保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，0VRTP1 : 5 ; -GCCATTAACGGCCCACAGTTC-3 ; ；0VRTP2 ：5 ; -TGGTGGAGAGGTGAATTCAAG-3 ; 進(jìn)行real-time qRT-PCR分析。以ACTIN為內(nèi)參，擴(kuò)增內(nèi)參的引物序列為APl : 5' -AGGCAGGATTTGCTGGTGA-3' 和 AP2 :5' -ACCAGTGGTACGACCGCTA-3'，擴(kuò)增長度為 398bp。
[0040] 結(jié)果如圖1所示，MaOFPl在香蕉不同組織的熒光適時(shí)定量PCR表達(dá)分析，可以看 出，該基因主要在子房以及采后0天果實(shí)中表達(dá)，在其它組織中不表達(dá)或表達(dá)量很少。推測 其在果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成中具有重要作用。
[0041] 3、表達(dá)載體的擴(kuò)增
[0042] 提取香蕉葉片 DNA，以 Pl :5-CGCCATGGATGGAGTACCCATACGAC-3, P2 : 5-CGACTAGTGTATTGCTCAGCCAAC-3 為引物，得到 435bp 的 PCR 產(chǎn)物。
[0043]