專利名稱：利用est-ssr分子標記構(gòu)建荔枝核心種質(zhì)的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
荔枝Hitchi chinensis Sonn.)為無患子科{Sapindaceae)荔枝屬 Hitchf)植物，原產(chǎn)于我國南部，是重要的熱帶亞熱帶水果，也是世界最古老的栽培果樹之一，分布于東、西半球的熱帶和亞熱帶的廣闊地區(qū)，我國荔枝主要分布在北緯18° M° 30'的熱帶亞熱帶地區(qū)，主要栽培省份是廣東、廣西、福建、海南、臺灣、云南，此外，在四川、貴州、浙江的一些特殊小氣候區(qū)也有少量種植(張展薇等，1997)。吳淑嫻等(1996)年對各地的荔枝種質(zhì)資源進行了統(tǒng)計認為我國已發(fā)現(xiàn)的荔枝種質(zhì)達222份，現(xiàn)已增加至300多份(陳潔珍等 2003)。其中，廣東荔枝栽培面積最大，品種資源豐富，栽培品種也較多，目前，我國荔枝種質(zhì)資源保存主要是利用種質(zhì)資源圃。1988年建立的廣州荔枝圃到目前為止保存了包括廣東、 廣西、福建、四川、云南等地的野生、半野生和栽培品種等130多份種質(zhì)，是世界上最大的荔枝種質(zhì)基因庫。荔枝現(xiàn)存資源保存方式單一，各地幾乎僅采用建立資源圃進行田間種植保存，而且資源的重復保存現(xiàn)象較嚴重；其保護力度也遠遠不夠，荔枝的遺傳多樣性遭到嚴重的破壞(王艷瓊2008)。此外，由于荔枝是多年生木本植物，樹體大，作為資源保存，占地面積大， 隨著近年來遺傳資源數(shù)量的增加也給種質(zhì)資源的保存、研究與利用帶來了很大的困難。Frankel (1984)最早提出核心種質(zhì)(Core collection)即是以最小的資源份數(shù)和遺傳重復最大限度地代表該物種的遺傳多樣性。核心種質(zhì)的構(gòu)建能有效解決資源的重復保存，且由于資源數(shù)量大給育種工作者帶來的困難也能隨之解決。傳統(tǒng)的核心種質(zhì)的是用農(nóng)藝學和形態(tài)學數(shù)據(jù)來構(gòu)建的，但這些表型數(shù)據(jù)不能準確的反應群體固有的遺傳變異及材料間的遺傳關系(Gu et al，2005)，與表型數(shù)據(jù)相比，DNA 分子標記數(shù)據(jù)能直接反映出DNA序列水平上的變化，是構(gòu)建核心種質(zhì)的有效特征數(shù)據(jù)(李銀霞等2007)。目前，核心種質(zhì)已成為國際遺傳資源研究的熱點，在水稻等許多一年生作物上得至丨J 廣泛應用(Chandra 2002 ；Amalraj 2006 Juneja 2006 ；Ronfort 2006 ；Upadhyaya 2007)，在園藝作物花卉郁金香(Raamsdonk 2000)、梅花(明軍2005)和蠟梅(趙冰2007) 等上也有報道，在果樹上，僅在蘋果(Hokanson 1998)、果梅(高志紅等2008)、柚類(劉勇 2006)和桃(李銀霞等2007)上有少量報道?，F(xiàn)階段，缺乏荔枝核心種質(zhì)與分子指紋的構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供荔枝核心種質(zhì)與分子指紋的構(gòu)建方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是 荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；
2)根據(jù)荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設計EST-SSR引物；
3)使用EST-SSR引物進行PCR，擴增荔枝的基因組DNA；
4)對PCR產(chǎn)物進行電泳分析，得到其等位基因的存在數(shù)據(jù)；
5)對獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理，構(gòu)建核心種質(zhì)。優(yōu)選的，PCR的擴增程序為:94°c,4min ；94°C，Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 個循環(huán)；72°C，10min ；4°C，完成擴增。本發(fā)明方法中，EST-SSR標記的引物形成和實驗操作過程簡單，易操作，擴增譜帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定，適合于分析荔枝資源之間的遺傳多樣性，在此基礎上構(gòu)建的核心種質(zhì)幾乎代表了原種質(zhì)全部的遺傳多樣性，有很好的代表性，對荔枝種質(zhì)管理、新種質(zhì)收集及種質(zhì)繁殖更新具有現(xiàn)實意義，更重要的是促進了荔枝種質(zhì)資源利用的深入，從而提高荔枝種質(zhì)資源的利用效率。


圖1是三種相似系數(shù)下抽取不同樣品數(shù)保留的等位基因數(shù)。圖2是三種系數(shù)下構(gòu)建的核心種質(zhì)與原種質(zhì)的主坐標圖。圖3是9個EST-SSR標記的多態(tài)性類型分類簡圖。圖4 6分別是使用EST-SSR標記EST-21、EST-29、EST_30對96份荔枝種質(zhì)資源進行PCR產(chǎn)物的電泳分析圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，進一步說明本發(fā)明。1材料與方法 1.1植物材料
本實驗所采用的96個荔枝品種均取自廣東省農(nóng)科院果樹研究所的國家荔枝資源圃， 取樣時，挑選枝條生長健壯，且葉片無病蟲害的嫩葉，放入保鮮袋，然后用冰盒盛放，取完后迅速帶回實驗室，放在_80°C的超低溫冰箱儲藏備用。1.2 方法
1. 2. 1 DNA的提取
采用改進的SDS法(陳亮等，1997)(陳亮，陳大明，高其康等.茶樹基因組DNA提純與鑒定，茶葉科學，1997，17 (2) 172-176)提取基因組DNA0用PERKIN ELMER PTP6型紫外分光光度計測定其在230nm，260nm, 280nm處的紫外吸收光譜，根據(jù)OD26tl值算出樣品中DNA的濃度，并結(jié)合0. 8%瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA的質(zhì)量和濃度。為了最終實驗的方便和統(tǒng)一， 將每種樣品的DNA稀釋成大約IOng/ μ L，_20°C保存?zhèn)溆谩?.2.2引物的設計與退火溫度的確定
從荔枝cDNA文庫測序所得的EST序列，應用SSRIT (simple sequence repeat identification tool)軟件在線(http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索 EST-SSR，應用引物設計軟件I^rimer Premier 5. 0設計引物，由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。參考不同引物的Tm值，采用梯度PCR確定相應的退火溫度。選用10個品種的基因組DNA對能擴出目的條帶的引物進行多態(tài)性篩選，選擇多態(tài)性高、重現(xiàn)性好的引物作為以后全部96份資源擴增的核心引物。1. 2. 3 PCR擴增與電泳檢測
本實驗采用 25 μ 1 反應體系CldH2O 17.5“1，8吐€61~(含]\%2+)2.5“1，(1^138 0. 5μ 1, Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，primer各1 μ 1，模板DNA 2 μ 1.優(yōu)化的荔枝SSR-PCR的擴增反應程序:94°C,4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35cycles ；72°C, IOmin ；4°C，完成擴增。PCR產(chǎn)物，先在2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，然后再在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測。最后用數(shù)碼相機拍照，保存。1. 2. 4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、處理和分析
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計SSR是一種共顯性標記，根據(jù)其擴增產(chǎn)物在電泳膠上出現(xiàn)譜帶的位置和頻率，將不同材料某位點存在的等位基因記為1，不存在的記為0。數(shù)據(jù)的處理和分析所有記錄的數(shù)據(jù)均錄入計算機，然后利用NTSYS 2. IOe生物學軟件進行相似性數(shù)據(jù)分析，相似系數(shù)采用Dice、SM和Jaccard系數(shù)進行UPGMA聚類。1. 2. 5核心種質(zhì)的構(gòu)建
利用相似系數(shù)Dice、SM和Jaccard估測遺傳距離，用NTSYSpc-2. IOe軟件進行 UPGMA聚類分析，根據(jù)Hu等(2000)的多次聚類方法(Hu J, Zhu J，Xu H M. Methods of constructing core collections by stepwise clustering with three sampling strategies based on the genotypic values of crops. Theoretical and Applied Genetics, 2000，101:沈4力68)，利用張春雨等(2009)提出的位點優(yōu)先取樣策略(張春雨，陳學森，張艷敏等.采用分子標記構(gòu)建新疆野蘋果核心種質(zhì)的方法.中國農(nóng)業(yè)科學[J]，2009， 42(2) :597-604)構(gòu)建核心種質(zhì)。1. 2. 6核心種質(zhì)的評價與確認
通過P0PGENE 1.32來計算等位基因數(shù)(A)、Nei，s基因多樣度(He)、香農(nóng)信息指數(shù) (Ho)，用SPSS 13. 0軟件進行t檢驗和計算核心種質(zhì)相對于原種質(zhì)的保留率來確認其代表性，然后采用柱坐標軸分析法來確認核心種質(zhì)。2結(jié)果與分析
2. 1 EST-SSR的特點與多態(tài)性
從3391條荔枝EST序列中，篩選出305條含有SSR，比例為8. 99%，而陳海梅(2005)在小麥上得到比例為1.34%，說明荔枝的EST序列中含有豐富的SSR。根據(jù)以上SSR序列共設計了 100對EST-SSR引物對，有62對在荔枝上有擴增產(chǎn)物，有30對引物能96個荔枝樣品上擴出清晰，多態(tài)性高的條帶，共擴出284條帶，不同引物的擴增條帶在3 18條，平均9. 47， 其中有282條為多態(tài)性帶，多態(tài)率高達99. 30 %。2. 2遺傳多樣性分析
用EST-SSR標記對96份荔枝資源進行擴增，其遺傳多樣性見表1.從表看出，每對引物的Nei，s基因多樣度范圍0. 186 0. 396，香農(nóng)信息指數(shù)范圍0. 318 0. 558，由此說明96 份荔枝資源有豐富的遺傳多樣性。表1 EST-SRR標記下96份荔枝資源的遺傳多樣性
權(quán)利要求
1.荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；2)根據(jù)荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設計EST-SSR引物；3)使用EST-SSR引物進行PCR，擴增荔枝的基因組DNA；4)對PCR產(chǎn)物進行電泳分析，得到其等位基因的存在數(shù)據(jù)；5)對獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理，構(gòu)建核心種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，其特征在于PCR的擴增程序為 94°C，4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 個循環(huán)；72°C, IOmin ；4°C，完成擴增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，其特征在于使用的EST-SSR引物為 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :59、 SEQ ID NO :60。
全文摘要
本發(fā)明公開了荔枝核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，包括以下步驟選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；根據(jù)荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設計EST-SSR引物；使用EST-SSR引物進行PCR，擴增基因組DNA；對PCR產(chǎn)物進行電泳分析，得到其等位基因的存在數(shù)據(jù)；對獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理，構(gòu)建核心種質(zhì)。本發(fā)明方法EST-SSR標記的引物形成和實驗操作過程簡單，易操作，擴增譜帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定，適合于分析荔枝資源之間的遺傳多樣性，在此基礎上構(gòu)建的核心種質(zhì)幾乎代表了原種質(zhì)全部的遺傳多樣性，有很好的代表性，對荔枝種質(zhì)管理、新種質(zhì)收集及種質(zhì)繁殖更新具有現(xiàn)實意義，更重要的是促進了荔枝種質(zhì)資源利用的深入，從而提高荔枝種質(zhì)資源的利用效率。
文檔編號C12N15/10GK102174510SQ20111000182
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者向旭, 孫清明, 李志強, 歐良喜, 蔡長河, 袁沛元, 邱燕萍, 陳潔珍 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所