專利名稱：一種β-葡聚糖酶的高效制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種β -葡聚糖酶基因工程菌的構建及β -葡聚糖酶的高效制備方法，屬于基因工程和酶工程技術領域。
背景技術：
β -葡聚糖酶(β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 73))可以催化β -葡聚糖的水解反應。β-葡聚糖酶在食品、釀造、造紙和日化等許多方面有著廣泛的應用，其研究越來越受到重視。在啤酒生產(chǎn)中，因麥芽含有β-葡聚糖，造成麥汁粘度過大致使過濾困難，延長糖化醪過濾時間，降低麥汁得率，影響啤酒質量的穩(wěn)定性。葡聚糖酶能將麥芽中的葡聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細胞壁，使細胞內容物大量地釋放出來，提高麥汁得率， 降低醪液粘度而縮短糖化醪過濾時間，所獲麥汁特別清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫勻而持久。因此，將葡聚糖酶用于啤酒糖化和發(fā)酵過程，可降低成本，提高糖化過濾設備的效能，有利于啤酒的質量提高及穩(wěn)定。在農(nóng)作物品種的改良和病原菌的生物防治方面，多種植物的病原真菌細胞壁的主要成份都是β-1，3-葡聚糖和幾丁質，β-葡聚糖酶的水解活性能夠抑制真菌的生長與增殖。因此β-1，3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物質之一。在以大麥麥芽為原料的麥類飼料加工過程中，添加β-葡聚糖酶有效消除β-葡聚糖引起的單胃動物消化道黏度增加，提高飼料的可消化性、促進動物對營養(yǎng)的吸收，提高飼料的生物轉化率，改善畜禽生產(chǎn)性能，同時減少排泄物對環(huán)境的污染。β -葡聚糖酶生產(chǎn)菌株主要有綠色木霉和解淀粉芽孢桿菌兩種，其發(fā)酵水平一般在1，000 IU/mL發(fā)酵液左右(1 IU定義為1 min水解大麥β -葡聚糖產(chǎn)生1 μ mol還原糖 (以葡萄糖計)所需的酶量，下同)。采用基因工程手段是迅速提高葡聚糖酶生產(chǎn)水平的有效途徑，目前國內外已有綠色木霉、解淀粉芽孢桿菌、多黏芽孢桿菌等多種微生物葡聚糖酶編碼基因的報道。利用基因重組微生物表達葡聚糖酶也有許多成功的報道，但大多以大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母為表達宿主，Seiss M等對芽孢梭菌的β-葡聚糖酶基因進行了基因克隆和序列分析；Chie Kohchi和Akio Tohe從假絲酵母中克隆到β -葡聚糖酶基因，并在釀酒酵母中進行了表達研究；高雯等實現(xiàn)了綠色木霉LTR. 2 β -1，3-葡聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達；陳惠等通過PCR方法將已克隆的內切葡聚糖酶基因信號肽編碼序列去除，然后與表達載體PHIS1525連接后轉化大腸桿菌DH5ci，篩選出陽性轉化子DH5a-pHIS1525-G7并提取質粒進一步轉化巨大芽孢桿菌WH320原生質體，獲得基因工程菌WH320-pHIS1525-G7 ；李永仙等構建的重組大腸桿菌表達來源于解淀粉芽孢桿菌的β-葡聚糖酶，發(fā)酵水平達到1883 IU/mL，而且表達產(chǎn)物成功分泌到細胞外，這是到目前為止有文獻報道的葡聚糖酶分泌表達的最高水平。由于大腸桿菌不適于作為宿主大規(guī)模表達異源蛋白，而芽孢桿菌是大規(guī)模生產(chǎn)工業(yè)酶制劑的常用系統(tǒng)，因此研究芽孢桿菌系統(tǒng)分泌表達β -葡聚糖酶方法具有很大的應用前景。本發(fā)明公開了高效表達葡聚糖酶的解淀粉芽孢桿菌基因工程菌的構建方法及其高效制備技術。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供了一種產(chǎn)葡聚糖酶的菌株解淀粉芽孢桿菌/ pUB-PQQ-知以/。本發(fā)明的目的之二是提供了一種用于芽孢桿菌表達系統(tǒng)的人工雜合啟動子的構建方法。本發(fā)明的目的之三是提供了一種在人工雜合啟動子介導下通過解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵高效制備β-葡聚糖酶的技術。本發(fā)明提供一種人工雜合啟動子構建方法和β-葡聚糖酶基因的密碼子優(yōu)化方法，以及在該啟動子介導下利用解淀粉芽孢桿菌高效制備β-葡聚糖酶的技術。根據(jù)解淀粉芽孢桿菌中溫α-淀粉酶的密碼子偏愛性，將β-葡聚糖酶的部分氨基酸密碼子進行人工替換，人工合成優(yōu)化后的β-葡聚糖酶DNA序列；將來源于地衣芽孢桿菌高溫α-淀粉酶啟動子和來源于解淀粉芽孢桿菌的中溫α-淀粉酶啟動子片段進行不同方式的組合，人工合成轉錄效率較高的雜合啟動子；將人工合成的葡聚糖酶置于雜合啟動子下游構建重組表達載體，然后導入解淀粉芽孢桿菌宿主菌種，通過慶大霉素抗性平板篩選陽性克??；將重組菌分別在搖瓶、30L發(fā)酵罐、600L發(fā)酵罐和8噸發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)制備β -葡聚糖酶。為實現(xiàn)本發(fā)明的技術目的，本發(fā)明采取以下技術方案
一種產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌/pUB-PQQ-如·以/，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2010344。所述菌株CCTCC NO =M 2010344，其所含有的經(jīng)密碼子優(yōu)化并人工合成的β -葡聚糖酶基因如·以/，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。由于不同微生物密碼子的使用頻率不同，且存在著明顯的傾向性，并且細胞內對應的、RNA量與密碼子的使用頻率成正比，tRNA的豐度也是與密碼子的偏好性相聯(lián)系的。含量豐富的tRNA所識別的密碼子要比稀少tRNA所識別的密碼子使用頻率要高。根據(jù)這個原則，優(yōu)化了來源于地衣芽孢桿菌的β-葡聚糖酶編碼基因密碼子，所述菌株CCTCC NO =M 2010344，其所述的人工合成的β-葡聚糖酶基因如·Μ/，人工合成及克隆的步驟如下
(1)選擇解淀粉芽孢桿菌能夠高效分泌表達的中溫α-淀粉酶基因為參照物，通過生物信息學軟件分析中溫α-淀粉酶基因的密碼子偏愛性；
(2)獲得解淀粉芽孢桿菌的β-葡聚糖酶氨基酸序列GenBank No: ΑΒΥ71827. 1，根據(jù)密碼子簡并特性由氨基酸序列推測出DNA序列，并以步驟(1)的中溫α-淀粉酶基因密碼子偏愛性信息為依據(jù)，優(yōu)化葡聚糖酶基因密碼子在不改變氨基酸序列的前提下分別將β -葡聚糖酶編碼基因中編碼谷氨酸Glu、谷氨酰胺Glru半胱氨酸Cys、絲氨酸kr的密碼子GAG，CAA, UGU，UCU對應分別替換為GAA，CAG, UGC, UCA ； β -葡聚糖酶基因共有13個堿基被置換，密碼子優(yōu)化后得到β -葡聚糖酶基因bglAI ；
步驟(1)和步驟(2)所述的解淀粉芽孢桿菌是feciBm amyloliquefaciens ；
(3)以人工合成的知以/基因為模板，設計引物PCR擴增該基因，將該基因克隆到pMD-T easy載體中，獲得重組質粒pMD-如·以/。
PCR擴增所用的引物為
F 5' -CCATGGATGTTTTATCGTATGAAACGA-3‘， R 5' -TTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3‘，
其中在上游引物F的5'端加上AfcoI限制酶識別位點。PCR產(chǎn)物使用試劑盒純化回收， PCR產(chǎn)物克隆按照T載體說明書進行(Takara公司提供)。上述β-葡聚糖酶編碼基因密碼子優(yōu)化和克隆方法的步驟(2)中所述的堿基置換，沒有改變β-葡聚糖酶的氨基酸序列。堿基置換包含至少一個堿基的置換，但不僅限于 1個或幾個堿基的置換，較佳是5 10個堿基的置換，更佳的是1(Γ13個堿基的置換。上述β-葡聚糖酶編碼基因密碼子優(yōu)化和克隆方法中，所述的人工合成的β-葡聚糖酶編碼基因包含有自身的分泌信號肽序列。所述菌株CCTCC NO =M 2010344，其pUB-PQQ-^·^/所包含的雜合啟動子PQQ的構
建方法，
雜合啟動子PQQ構建方法，按如下步驟進行
(1)根據(jù)文獻報道(牛丹丹等.微生物學報.2006,46(4): 576-580)，獲得地衣芽孢桿菌14580的高溫α -淀粉酶基因的啟動子Pa _^，長度為180 bp ；
啟動子VamyL序列為SEQ ID NO: 4 ；
(2)根據(jù)文獻報道(劉洋等.工業(yè)微生物.2009，39(1):11-15)，獲得解淀粉芽孢桿菌的中溫α-淀粉酶基因的啟動子Pa j^，長度為200 bp ；啟動子序列為SEQ ID NO: 5 ；
(3)分別取步驟(1)中VamyL上游100bp序列，和步驟(2)中 a_下游100 bp,人工合成雜合啟動子PQQ ；雜合啟動子PQQ的核苷酸序列為SEQ ID NO: 6 ；
(4)設計引物，以人工合成的PQQ啟動子DNA為模板，PCR擴增該DNA片段，將擴增產(chǎn)物克隆到pMD-T easy載體中，獲得重組載體pMD_PQQ ；
所述PCR引物為
Pf 5' - AGCTTGAAGAAGTGAAGAAG-3‘
Pr 5' -CCATGGTTTTGACACTCCTTATTTGA-3 ‘，其中在下游引物 Pr 的 5 ‘端加上AfcoI 限制酶識別位點。上述選取VamyL上游100 bp序列，但不僅限于該片段長度，上游5(T200 bp 長度的DNA序列與VainyQ下游5(T200 bp長度的DNA序列進行雜合都能構建出有同樣效果的雜合啟動子；選取下游100 bp的DNA序列，但不僅限于該片段長度，VamyQ下游 50^200 bp長度的DNA序列與VernyL上游50 200 bp長度的DNA序列組合都能構建出具有同樣效果的雜合啟動子。所述菌株CCTCC NO =M 2010344,即pUB_PQQ_如·以/的構建方法，按照如下步驟進行
(1)將重組質粒pMD-Zw^/用限制酶和AfcoI進行雙酶切，36 38°C反應過夜，然后將酶切產(chǎn)物純化回收獲得如·以/基因片段；
(2)將重組載體pMD-PQQ用限制酶及和AfcoI進行雙酶切，36 38°C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化獲得PQQ啟動子片段；
(3)將質粒pUBllO(佟小雪等.生物技術.2009，19(5) 11-13)用和及進行雙酶切，36 38°C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再將該酶切產(chǎn)物與步驟(1)和(2)的酶切產(chǎn)物混合，用T4 DNA連接酶在3飛。C反應1Γ16 h，得連接產(chǎn)物；
(4)將連接產(chǎn)物電轉化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素15μ g/mL的培養(yǎng)基平板，35 37°C培養(yǎng)過夜，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)，然后提取小量質粒進行酶切驗證，得按正確方向插入目的基因的重組表達質粒，命名為pUB-PQQ-如·以/ ；
所述的枯草芽孢桿菌為feciBm subtilis 1A717 (佟小雪等.生物技術.2009， 19(5) 11-13)；
(5)培養(yǎng)步驟(4)獲得的陽性克隆，提取重組表達質粒，將該質粒用電轉化方法轉入解淀粉芽孢桿菌中，轉化后的菌液涂布濃度為5 μ g/mL卡那霉素抗性選擇培養(yǎng)基平板，37°C 培養(yǎng)14-16 h，篩選到含有重組質粒pUB-PQQ-/^^/的重組解淀粉芽孢桿菌；
所述的解淀粉芽孢桿菌為feciBM amyloliquefaciens (劉洋等.工業(yè)微生物. 2009，39(1) 11-15)。步驟(4)和步驟(5)中，所述的電轉化方法是一致的，電轉化所用的培養(yǎng)基如下 生長培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白陳、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、0.5 mol/L山梨醇。復蘇培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白陳、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、0. 7 mol/L甘露選擇培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白脈、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、5 g β-葡聚糖、 15 g瓊脂粉、5 mg卡那霉素。EP緩沖液每升含91. 1 g山梨醇、91. 1 g甘露醇、100 mL 100%甘油。電轉化方法如下
①在100 mL生長培養(yǎng)基中接入1 mL過夜培養(yǎng)的種子液。②37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至0D_為0. 6左右。φ 4°C離心收集細胞，用適量10%甘油洗滌細胞3次，并最終將細胞懸浮于400 μ L 10%甘油中。④每40 μ L分裝于1.5 mL Eppendorf管中，直接用于下一步轉化實驗或者_70°C 保藏備用。 混合40 μ L感受態(tài)細胞和2 μ L質粒，于1.6 kV，5 ms條件下進行電擊。 迅速加入1 mL復蘇培養(yǎng)基，然后37°C劇烈振蕩1 h。 將細胞涂布于選擇培養(yǎng)基上。通過篩選得到含有重組表達質粒pUB-PQQ-/^^/ 的解淀粉芽孢桿菌。利用所述的重組解淀粉芽孢桿菌pUB-PQQ-如·以/發(fā)酵制備β -葡聚糖酶的方法，步驟如下
(1)將在4°C保藏的含有pUB-PQQ-如·以/的重組解淀粉芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中， 37200 r/min，培養(yǎng)M h，獲得的種子培養(yǎng)液；
其中所述的種子培養(yǎng)基成分0. 5%酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化鈉；
(2)按照69TlO%的體積比將步驟(1)中獲得的種子培養(yǎng)液轉接于裝有15 20L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37 42°C，200 r/min，發(fā)酵84 h；
或將步驟(1)中獲得的種子培養(yǎng)液按0. 2%的體積比接種量接種于含600L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37°C，200 r/min，培養(yǎng)時間M 36 h；
其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分棉籽粉2. 5% 4%，乳糖2% 4%，磷酸二氫鉀40 60 mmol/ LJ ρΗ6· 5 ；
(3)將步驟(2)獲得的發(fā)酵液作為種子按1%體積比接種量轉接于裝有6噸發(fā)酵培養(yǎng)基的8噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37、2°C，200 r/min，培養(yǎng)時間76、6 h，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分與步驟(2)相同；
(4)步驟(2)或(3)的獲得的β-葡聚糖酶發(fā)酵液酶活達到2，800 3，200 IU/mL (1 IU 定義為1 min水解大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1 ymol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量，下同)， 收集發(fā)酵液通過陶瓷膜微濾和超濾膜超濾后獲得β-葡聚糖酶濃縮液；
所述的陶瓷膜，其材質為柱狀氧化鋁材質，其孔徑為0.45 μ m，通過回流閥壓力調節(jié)過濾速度，流速控制0. 4^0. 8 L/min，該設備可從市場購買；
所述的超濾膜為卷式超濾膜，其材質為聚醚砜，截留分子量為10 KD，超濾的溫度通過調節(jié)冷卻水的循環(huán)速度來進行控制，該設備可從市場購買獲得；
上述發(fā)酵制備β-葡聚糖酶方法中所用的培養(yǎng)基組分均可從生化試劑公司購買獲得。本發(fā)明的有益效果根據(jù)上述發(fā)酵制備葡聚糖酶方法，獲得的濃縮酶液中蛋白濃度達到3g/mL，β-葡聚糖酶的酶活達到了 ll，200 15，000IU/mL。生物材料樣品保藏一種產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌/pUB-PQQ-bglAI Bacillus amyloliquefaciens/pUB-PQQ-bglAI,已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2010344，保藏日期2010年12月13日。


圖1重組質粒pMD - bglAI物理圖譜。圖2重組質粒pMD-PQQ物理圖譜。圖3重組表達質粒pUB-PQQ-^·^/物理圖譜。
具體實施例方式實施例1重組質粒pMD-如·以/的構建
用DNAMAN軟件分別分析解淀粉芽孢桿菌中溫α-淀粉酶基因的密碼子偏愛性和 β-葡聚糖酶氨基酸序列；將β-葡聚糖酶基因中編碼谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gin)、半胱氨酸(Cys)、絲氨酸(Ser)的密碼子GAG, CAA, UGU, UCU分別替換為GAA，CAG, UGC, UCA。 在不改變安靜酸序列的前提下，共有13個堿基被置換，將密碼子優(yōu)化后的DNA序列遞交上海生工公司進行合成全長732 bp的如·以/基因；以如·以/基因為模板，用引物F: 5' -CCATGGATGTTTTATCGTATGAAACGA-3‘，
R: 5' -TTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3‘進行 PCR 擴增 bglAI 片段，擴增條件是 94°C， 3min;94°C，50 s，55°C，90 s，72°C，60 s，30 個循環(huán)；72°C，10 min ;PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后， 與克隆載體PMD-T easy (大連寶生物公司)混合，4 16°C過夜連接，連接體系為20 yL的反應體系中含2 X Buffer 5 μ L，PCR產(chǎn)物4 μ L, pMD-T easy質粒1 μ L，用雙蒸水補足 20μ L ；將連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，涂布于LB平板(氨芐青霉素濃度100 yg/mL)，37°C培養(yǎng)纊10 h，挑取單菌落培養(yǎng)，小量提取質粒后進行酶切電泳驗證，獲得含有重組質粒陽性克隆；大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化等參照Sambrook J, Russell Dff.分子克隆實驗指南進行。實施例2重組質粒pMD-PQQ的構建
根據(jù)文獻報道，獲得地衣芽孢桿菌14580的ISObp的高溫α -淀粉酶基因啟動子和解淀粉芽孢桿菌的200 bp長度的中溫α-淀粉酶基因啟動子分別取Pa 對上游 100 bp序列和下游100 bp，按照上下順序由上海生工公司合成全長200 bp的雜合啟動子PQQ ；設計引物，以PQQ為模板，用引物
Pf 5' - AGCTTGAAGAAGTGAAGAAG-3‘，
Pr 5 ‘ -CCATGGTTTTGACACTCCTTATTTGA-3 ‘(下劃線為 AfcoI 酶切位點)PCR 擴增 PQQ 片段，擴增條件是 94°C，3min ;94°C，50 s，55°C，90 s，72°C，60 s，30 個循環(huán)；72°C，10 min ； PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，與克隆載體pMD-T easy (大連寶生物公司)混合，4 16°C過夜連接， 連接體系為20 μ L的反應體系中含2XBuffer 5 μ L，PCR產(chǎn)物4 μ L，pMD-T easy質粒 1 μ L，用雙蒸水補足20 μ L ；將連接混合物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，涂布于LB平板(氨芐青霉素濃度100 yg/mL)，37°C培養(yǎng)8-10 h，挑取單菌落培養(yǎng)，小量提取質粒后進行酶切電泳驗證，獲得含有重組質粒PMD-PQQ陽性克??；大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化等參照Sambrook J, Russell DW分子克隆實驗指南進行。實施例3重組質粒pUB-PQQ-勒·以/的構建
將重組質粒PMD-Zw^/用限制酶和Afco I進行雙酶切，36 38 °C反應過夜，然后將酶切產(chǎn)物純化回收獲得力穿以/基因片段；將重組載體pMD-PQQ用限制酶漢3 HI和AfcoI進行雙酶切，36 38°C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化獲得PQQ啟動子片段；用和及雙酶切質粒PUB110，36 38°C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化；分別將回收純化后的bglAI片段、PQQ片段和PUBl 10進行混合，用T4 DNA連接酶在;T5°C反應1Γ16 h，得連接反應物；將連接產(chǎn)物電轉化枯草芽孢桿菌feciBM subtilis 1A717感受態(tài)細胞，涂布選擇培養(yǎng)基平板(含卡那霉素5 μ g/mL)，35 37°C培養(yǎng)過夜，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)，然后提取小量質粒進行酶切驗證，可得目的基因按正確方向連接的重組表達質粒，命名為pUB-PQQ-如·以/。 電轉化的步驟如下①在100 mL生長培養(yǎng)基中接入1 mL過夜培養(yǎng)的種子液；②37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6左右；③4°C離心收集細胞，用適量10%甘油洗滌細胞3次，并最終將細胞懸浮于400 μ 1 10%甘油中；④每40 μ 1分裝于1. 5 mLEppendorf管中，直接用于下一步轉化實驗或者_70°C保藏備用；⑤混合40 μ L感受態(tài)細胞和2 μ L質粒，于1.6 kV， 5 ms條件下進行電擊；⑥迅速加入1 mL復蘇培養(yǎng)基，然后37°C劇烈振蕩1 h ；⑦將細胞涂布于選擇培養(yǎng)基上。電轉化所用到的培養(yǎng)組成如下生長培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白陳、 5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、0.5 mol/L山梨醇；復蘇培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白陳、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、0.7 mol/L甘露醇；選擇培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白脈、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、5 g β-葡聚糖、15 g瓊脂粉、5 mg卡那霉素。
實施例4分泌表達β -葡聚糖酶的重組解淀粉芽孢桿菌構建
從含有pUB-PQQ-如·以/重組質粒的枯草芽孢桿菌中提取質粒，將該質粒用電轉化方法轉入解淀粉芽孢桿菌中，轉化后的菌液涂布選擇培養(yǎng)基平板(5 μ g/mL卡那霉素)，37°C培養(yǎng)14-16 h，篩選到含有重組質粒pUB-PQQ-/^^/的重組解淀粉芽孢桿菌。電轉化方法和所用的培養(yǎng)基組分均與實施例3中枯草芽孢桿菌轉化方法相同。
實施例5重組解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵制備β -葡聚糖酶
將在4°C保藏的含有pUB-PQQ-如·以/的重組解淀粉芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基(0. 5% 酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化鈉)中，37°C，200 r/min，培養(yǎng)M h ；將培養(yǎng)的種子液按0. 2%的體積比接種量接種于含600 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37°C，200 r/min，培養(yǎng)時間M 36 h，發(fā)酵培養(yǎng)基成分棉籽粉2. 5 4 %，乳糖2 4%，磷酸二氫鉀40 60 mmol/L，調 PH6. 5 ；將上述培養(yǎng)的發(fā)酵液作為種子按1%體積比接種量轉接于裝有6噸發(fā)酵培養(yǎng)基的8 噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37 42°C，200 r/min，培養(yǎng)時間76、6 h，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組分同前；發(fā)酵結束，β -葡聚糖酶發(fā)酵液酶活達到2，800^3, 200 IU/mL,收集8噸發(fā)酵罐中的發(fā)酵液，通過0. 45 μ m陶瓷膜微濾和截留分子量為10 KD超濾膜超濾后獲得β -葡聚糖酶濃縮液，測定濃縮液的酶活，濃縮酶液中蛋白濃度達到3 g/mL, β-葡聚糖酶的酶活達到了 11，200 15，000 IU/mL。
權利要求
1.一種產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌/PUB-PQQ-如·以/，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO =M 2010344。
2.根據(jù)權利要求1所述菌株CCTCCNO =M 2010344，其特征在于所含有的經(jīng)密碼子優(yōu)化并人工合成的β-葡聚糖酶基因如·以/，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。
3.根據(jù)權利要求2所述菌株CCTCCNO =M 2010344，其特征在于所述的人工合成的 β -葡聚糖酶基因bglAI,人工合成及克隆的步驟如下(1)選擇解淀粉芽孢桿菌能夠高效分泌表達的中溫α-淀粉酶基因為參照物，通過生物信息學軟件分析中溫α-淀粉酶基因的密碼子偏愛性；(2)獲得解淀粉芽孢桿菌的β-葡聚糖酶氨基酸序列GenBank No: ΑΒΥ71827. 1，根據(jù)密碼子簡并特性由氨基酸序列推測出DNA序列，并以步驟(1)的中溫α-淀粉酶基因密碼子偏愛性信息為依據(jù)，優(yōu)化葡聚糖酶基因密碼子在不改變氨基酸序列的前提下分別將β -葡聚糖酶編碼基因中編碼谷氨酸Glu、谷氨酰胺Glru半胱氨酸Cys、絲氨酸Ser的密碼子GAG，CAA, UGU，UCU對應分別替換為GAA，CAG, UGC, UCA ； β -葡聚糖酶基因共有13個堿基被置換，密碼子優(yōu)化后得到β -葡聚糖酶基因bglAI ；步驟(1)和步驟(2)所述的解淀粉芽孢桿菌是feciBm amyloliquefaciens ；(3)以人工合成的知以/基因為模板，設計引物PCR擴增該基因，將該基因克隆到pMD-T easy載體中，獲得重組質粒；PCR擴增所用的引物為F 5' -CCATGGATGTTTTATCGTATGAAACGA-3‘，R 5' -TTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3‘，其中在上游引物F的5'端加上AfcoI限制酶識別位點。
4.根據(jù)權利要求1所述菌株CCTCCNO =M 2010344，其特征在于pUB-PQQ-/^^/所包含的雜合啟動子PQQ的構建方法，雜合啟動子PQQ構建方法，按如下步驟進行(1)獲取地衣芽孢桿菌14580的高溫α-淀粉酶基因的啟動子Pamyi，長度為180 bp ； 啟動子VamyL序列為SEQ ID NO: 4 ；(2)獲取解淀粉芽孢桿菌的中溫α-淀粉酶基因的啟動子Pa j^，長度為200bp ；啟動子 Pafflj^ 序列為 SEQ ID NO: 5 ；(3)分別取步驟(1)中VamyL上游IOObp序列，和步驟(2)中下游100bp，人工合成雜合啟動子PQQ ；雜合啟動子PQQ的核苷酸序列為SEQ ID NO: 6 ；(4)設計引物，以人工合成的PQQ啟動子DNA為模板，PCR擴增該DNA片段，將擴增產(chǎn)物克隆到pMD-T easy載體中，獲得重組載體pMD_PQQ ；所述PCR引物為Pf 5' - AGCTTGAAGAAGTGAAGAAG-3‘Pr 5' -CCATGGTTTTGACACTCCTTATTTGA-3 ‘，其中在下游引物 Pr 的 5 ‘端加上AfcoI 限制酶識別位點。
5.根據(jù)權利要求1所述菌株CCTCCNO =M 2010344，即pUB-PQQ-如·以/的構建方法，其特征在于按照如下步驟進行(1)將重組質粒pMD-知以/用限制酶和AfcoI進行雙酶切，36 38°C反應過夜，然后將酶切產(chǎn)物純化回收獲得如·以/基因片段；(2)將重組載體pMD-PQQ用限制酶及和AfcoI進行雙酶切，36 38°C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化獲得PQQ啟動子片段；(3)將質粒pUBllO用和及進行雙酶切，36 38°C反應過夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再將該酶切產(chǎn)物與步驟(1)和(2)的酶切產(chǎn)物混合，用T4 DNA連接酶在3飛。C反應 1Γ16 h，得連接產(chǎn)物；(4)將連接產(chǎn)物電轉化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素15μ g/mL的培養(yǎng)基平板，35 37°C培養(yǎng)過夜，挑選陽性克隆，并進行培養(yǎng)，然后提取小量質粒進行酶切驗證，得按正確方向插入目的基因的重組表達質粒，命名為pUB-PQQ-如·以/ ；所述的枯草芽孢桿菌為feciB^s subtilis 1A717 ；(5)培養(yǎng)步驟(4)獲得的陽性克隆，提取重組表達質粒，將該質粒用電轉化方法轉入解淀粉芽孢桿菌中，轉化后的菌液涂布濃度為5 μ g/mL卡那霉素抗性選擇培養(yǎng)基平板，37°C 培養(yǎng)14-16 h，篩選到含有重組質粒pUB-PQQ-/^^/的重組解淀粉芽孢桿菌；所述的解淀粉芽孢桿菌為feciB^s amyIoliquefaciens ；步驟(4)和步驟(5)中，所述的電轉化方法是一致的，電轉化所用的培養(yǎng)基如下生長培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白陳、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、0.5 mol/L山梨醇；復蘇培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白陳、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、0.7 mol/L甘露醇；選擇培養(yǎng)基每升含10 g胰蛋白脈、5 g酵母浸提物、5 g氯化鈉、5 g β-葡聚糖、15 g瓊脂粉、5 mg卡那霉素;EP緩沖液每升含91. 1 g山梨醇、91. 1 g甘露醇、100 mL 100%甘油；電轉化方法如下①在100mL生長培養(yǎng)基中接入1 mL過夜培養(yǎng)的種子液；②37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ；③4°C離心收集細胞，用適量10%甘油洗滌細胞3次，并最終將細胞懸浮于400μ L 10% 甘油中；④每40μ L分裝于1.5 mL Eppendorf 管中，直接用于下一步轉化實驗或者-70°C保藏⑤混合40μ L感受態(tài)細胞和2 μ L質粒，于1. 6 kV，5 ms條件下進行電擊；⑥迅速加入1mL復蘇培養(yǎng)基，然后37°C劇烈振蕩1 h ； 將細胞涂布于選擇培養(yǎng)基上，通過篩選得到含有重組表達質粒pUB-PQQ-^·^/的解淀粉芽孢桿菌。
6.利用權利要求1所述的重組解淀粉芽孢桿菌pUB-PQQ-^·^/發(fā)酵制備β-葡聚糖酶的方法，其特征在于，步驟如下(1)將在4°C保藏的含有pUB-PQQ-如·以/的重組解淀粉芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中， 37200 r/min，培養(yǎng)M h，獲得種子培養(yǎng)液；其中所述的種子培養(yǎng)基成分0. 5%酵母膏，1%蛋白胨，1%氯化鈉；(2)按照69TlO%的體積比將步驟(1)中獲得的種子培養(yǎng)液轉接于裝有15 20L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37 42°C，200 r/min，發(fā)酵84 h；或將步驟(1)中獲得的種子培養(yǎng)液按0. 2%的體積比接種量接種于含600L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37°C，200 r/min，培養(yǎng)時間對 36 h ；其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分棉籽粉2.5% 4%，乳糖2% 4%，磷酸二氫鉀40 60 mmol/ LJ ρΗ6· 5 ；(3)將步驟(2)獲得的發(fā)酵液作為種子按1%體積比接種量轉接于裝有6噸發(fā)酵培養(yǎng)基的8噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為37、2°C，200 r/min，培養(yǎng)時間76、6 h，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分與步驟(2)相同；(4)步驟(2)或(3)的獲得的β-葡聚糖酶發(fā)酵液酶活達到2，800 3，200 IU/mL，收集發(fā)酵液通過陶瓷膜微濾和超濾膜超濾后獲得β-葡聚糖酶濃縮液；所述的陶瓷膜，其材質為柱狀氧化鋁材質，其孔徑為0.45 μ m，通過回流閥壓力調節(jié)過濾速度，流速控制0. 4^0. 8 L/min，該設備可從市場購買；所述的超濾膜為卷式超濾膜，其材質為聚醚砜，截留分子量為10 KD，超濾的溫度通過調節(jié)冷卻水的循環(huán)速度來進行控制，該設備可從市場購買獲得；獲得的β-葡聚糖酶濃縮液中蛋白濃度達到3 g/mL, β-葡聚糖酶的酶活達到 11，200 15，000 IU/mL。
全文摘要
一種β-葡聚糖酶的高效制備方法，屬于基因工程和酶工程技術領域。本發(fā)明涉及一種β-葡聚糖酶基因工程菌pUB-PQQ-bglAI，保藏編號CCTCCNOM2010344。將β-葡聚糖酶的部分氨基酸密碼子進行人工替換，人工合成β-葡聚糖酶基因bglAI；將來源于地衣芽孢桿菌高溫α-淀粉酶啟動子和來源于解淀粉芽孢桿菌的中溫α-淀粉酶啟動子片段進行組合成雜合啟動子PQQ；構建重組表達載體，然后導入解淀粉芽孢桿菌宿主菌中，得到重組菌pUB-PQQ-bglAI。分別在搖瓶、30L發(fā)酵罐、600L發(fā)酵罐和8噸發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶，發(fā)酵液酶活達到2,800~3,200IU/mL，收集發(fā)酵液超濾微濾，獲得蛋白濃度3g/mL的β-葡聚糖酶濃縮液，酶活達到11,200~~15,000IU/mL。
文檔編號C12N15/56GK102168059SQ201110001750
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權日2011年1月6日
發(fā)明者王正祥 申請人:江蘇銳陽生物科技有限公司