β-丙氨酸的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種β -丙氨酸的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β-丙氨酸(β-alanine)，即3-氨基丙酸(3_aminopropanoic)，是自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸，丙氨酸作為一種重要的生化原料，其在醫(yī)藥、飼料以及食品領(lǐng)域都有著十分廣泛的應(yīng)用。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，國(guó)內(nèi)外企業(yè)主要以化學(xué)合成法生產(chǎn)丙氨酸，如丙烯腈法、氨基丙腈法以及琥珀酰亞銨降解法，但是，采用上述的化學(xué)合成法生產(chǎn)β -丙氨酸時(shí)會(huì)環(huán)境的污染較為嚴(yán)重，特別采用含腈原料，對(duì)環(huán)境及生物體都有極大的毒性。
[0004]為了克服上述技術(shù)缺陷，經(jīng)研宄報(bào)道，目前已有多家企業(yè)采用生物合成法生產(chǎn)β -丙氨酸，比如:使用藤黃八疊球菌將丙烯酸轉(zhuǎn)化為β -丙氨酸，β -丙氨酸的轉(zhuǎn)化率為54%左右；選用大腸桿菌BL21 (DE3)作為宿主表達(dá)來源于大腸桿菌的L-天冬氨酸-α羧化酶；另外，中國(guó)文獻(xiàn)公開了一種名稱為“一種生物催化合成β -丙氨酸的方法”的發(fā)明專利(公開號(hào)為CN102851333A)，該發(fā)明專利公開的技術(shù)方案是以富馬酸為底物采用含酶的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行酶催化生產(chǎn)丙氨酸，但是該方法不僅工藝條件復(fù)雜，轉(zhuǎn)化率低，而且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，副產(chǎn)物較多。
[0005]由此可見，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)丙氨酸的方法要么對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，要么就是存在丙氨酸轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)等缺陷，因此，如何提高丙氨酸的轉(zhuǎn)化率，實(shí)現(xiàn)丙氨酸的低污染、高效率生產(chǎn)，還有待研宄人員的深入研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)清潔、轉(zhuǎn)化率高的β -丙氨酸的制備方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種β -丙氨酸的合成方法，其步驟如下:
[0008]a)配制底物:向酶反應(yīng)器中投入L-天冬氨酸底物溶液；
[0009]b)酶催化反應(yīng):向底物溶液中加入含酶菌液進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)過程中分批次加入適量L-天冬氨酸以控制反應(yīng)物的pH在5.0-9.0內(nèi)，所述含酶菌液由高產(chǎn)L-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮、破碎后得到；
[0010]c)將酶反應(yīng)器中的反應(yīng)物進(jìn)行過濾、脫色、結(jié)晶處理，即得β -丙氨酸。
[0011]采用上述技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果在于:1.采用含酶菌液進(jìn)行生物催化反應(yīng)使L-天冬氨酸一步法轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，該方法清潔環(huán)保；2.目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率高，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，采用本申請(qǐng)公開的技術(shù)方案使得丙氨酸的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.5%，因此該方法可以進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)推廣應(yīng)用；3.目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)能高，所述的高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌是由中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所研發(fā)，詳細(xì)信息可參見該單位申請(qǐng)的名稱為“一種高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生產(chǎn)丙氨酸中的應(yīng)用”的發(fā)明專利(專利號(hào)為CN201310534782.2)，另外，關(guān)于高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮、破碎以獲取所述的含酶菌液的步驟，其可以直接采用常規(guī)的菌體發(fā)酵處理方法即可，具體的，也可以參見申請(qǐng)人于該申請(qǐng)同日提交的名稱為“菌體細(xì)胞的破碎方法”的申請(qǐng)專利，具體的，該發(fā)明專利中記載的破碎后得到的菌體細(xì)胞液即為本申請(qǐng)所述的原料含酶菌液。
[0012]作為進(jìn)一步的方案:所述步驟a是向酶反應(yīng)器中投入水和L-天冬氨酸配制成濃度為5g/L-80g/L的底物溶液，用堿化劑調(diào)pH為5.0-8.5 ;所述步驟b中的高產(chǎn)L-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌工程菌中的一種；所述步驟b中的含酶菌液是由大腸桿菌或枯草芽孢桿菌工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮、破碎后得到，其中發(fā)酵培養(yǎng)條件為:通氣量 0.5vvm，轉(zhuǎn)速 250rpm，溫度 25°C _35°C，pH 為 6.0-8.5。
[0013]所述步驟b中的催化反應(yīng)是采用流加酶法為N個(gè)階段進(jìn)行:階段一至N分別向酶反應(yīng)器中加入多5% (按重量百分比)含酶菌液進(jìn)行催化反應(yīng)，每階段反應(yīng)超過2h。當(dāng)然，在催化反應(yīng)的各階段，需要分批次向酶反應(yīng)器中加入適量的L-天冬氨酸，以確保反應(yīng)物的PH值保持在5.0-9.0之間。具體的，采用上述技術(shù)方案主要有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn):第一、與一次性投入含酶菌液相比，采用流加酶法向酶反應(yīng)器中加入含酶菌液可以有效提高酶的利用率以及β -丙氨酸的轉(zhuǎn)化率；第二、整個(gè)催化反應(yīng)過程只需定期添加L-天冬氨酸以調(diào)節(jié)反應(yīng)物的PH值即可，無需加入其他酶活調(diào)節(jié)劑、誘導(dǎo)劑等，這樣一方面可以減小副產(chǎn)物的生產(chǎn)，另一方面也可以有效降低后序處理壓力；第三、采用上述的生產(chǎn)方法只需在常壓下進(jìn)行即可，且溫度條件溫和，操作簡(jiǎn)單，可進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。
[0014]更為具體的方案:所述步驟b中的催化反應(yīng)是采用流加酶法，為N個(gè)階段進(jìn)行:將含酶菌液按重量配比稱量分成N份，階段一至階段N分別向酶反應(yīng)器的底物溶液中至少加入重量百分比5%的含酶菌液進(jìn)行催化反應(yīng)，每階段反應(yīng)均超過2h，所述的N ^ 2 ;所述步驟b中催化反應(yīng)溫度為20°C -65°C ;所述的堿化劑為氫氧化鈉、氫氧化鉀或者氨水中的一種?？傮w上來說，對(duì)于催化反應(yīng)初期，轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速度較快，因此反應(yīng)溫度可以適當(dāng)偏低，后期L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度相對(duì)較慢，因此可以適當(dāng)升高至反應(yīng)溫度以加快反應(yīng)速度；
[0015]進(jìn)一步的，所述步驟c中的過濾處理是將反應(yīng)物先通過微濾處理，再將微濾透析液進(jìn)行超濾處理，得超濾透析液，其中微濾膜元件的孔徑為20nm-200nm，超濾膜元件的孔徑為lnm-50nm。所述的反應(yīng)物過濾處理?xiàng)l件為:過濾溫度為35°C _45°C，進(jìn)出口壓差為0.1Mpa-0.3Mpa。通過微濾處理即可除去其中的大分子蛋白雜質(zhì)，然后再將微濾透析液進(jìn)行超濾處理，因前道的微濾處理已除去其中的大分子蛋白雜質(zhì)，因此微濾透析液能夠快速通過超濾膜元件，同時(shí)除去其中的膠體雜蛋白以及糖類物質(zhì)，這樣得到的超濾透析液再經(jīng)過脫色和結(jié)晶處理，即得產(chǎn)品。另外，所述步驟c中的脫色處理是采用活性炭脫色，脫色時(shí)間為20min-120min，溫度為50°C _80°C，活性炭重量添加量是過濾透析液的0.5% -1% ;所述步驟c中的結(jié)晶處理工藝為:初始溫度為60°C -80°C，每小時(shí)溫度下降5°C -10°C，轉(zhuǎn)速50rpm-100rpm。關(guān)于脫色步驟，是在超濾透析液中加入活性炭，經(jīng)攪拌脫色后，采用板框過濾即可除去其中的活性炭。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過1-3實(shí)施例對(duì)本發(fā)明公開的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明:
[0017]實(shí)施例1: β -丙氨酸的制備
[0018]a)配制底物:準(zhǔn)備一容積為20m3的酶反應(yīng)器，先向酶反應(yīng)器中投入15m 3水，然后通過氣流輸送設(shè)備輸入300kg的L-天冬氨酸配制成濃度為20g/L的底物溶液，投入氫氧化鈉至PH為7.0，攪拌；
[0019]b)酶催化反應(yīng):分三個(gè)階段進(jìn)行，階段一向酶反應(yīng)器中加入0.2m3含酶菌液，在30°C -35 °C條件下進(jìn)行催化反應(yīng)4h ;階段二向酶反應(yīng)器中加入0.2m3含酶菌液，在35°C _45°C條件下進(jìn)行催化反應(yīng)4h;階段三向酶反應(yīng)器中加入0.2m3含酶菌液，在40°C _55°C條件下進(jìn)行催化反應(yīng)4h，其中，所述含酶菌液也就是申請(qǐng)人于該申請(qǐng)同日提交的名稱為“菌體細(xì)胞的破碎方法”的發(fā)明專利記載的破碎后的菌體細(xì)胞液；反應(yīng)過程中分批次加入適量