專利名稱:胸腺素α的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本申請是中國專利申請03131492.9的分案申請。
本發(fā)明涉及以天然或非天然氨基酸取代的胸腺素α1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，其制備方法，含它們的藥物組合物及其在治療或預(yù)防與免疫缺陷、免疫功能低下有關(guān)疾病的藥物中的用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS(嚴重急性呼吸綜合征)等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胸腺素α1(Tα1)是胸腺分泌的一種重要的多肽，是一種針對T淋巴細胞的免疫增強劑，能促進T細胞的成熟和分化，并促使成熟的T細胞分泌多種淋巴因子(如白介素-2和γ-干擾素等)，還能促進白介素-2受體的生成。Tα1由28個氨基酸殘基組成，分子量為3108，等電點為4.2，N-端含有乙酰化結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列如下1 10Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-20 28Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OHTα1具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)和顯著增強免疫功能的作用，其臨床應(yīng)用研究始于二十世紀八十年代，但關(guān)于其構(gòu)效關(guān)系研究的報道不多。Abiko等(Chem Pharm Bull，1980，283542-8)用E-玫瑰花結(jié)形成試驗證實Tα1的C-端部分片段具有一定的活性Tα1(100％)，14-28(9.83％)，19-28(1.04％)。Felix等(Int J Pept Protein Res，1985，26130-48)用免疫抑制小鼠試驗證實N-端片段1-4，4-10，1-10及1-14基本無活性；C-端片段15-28和18-28與Tα1活性相當，21-28(75％)，23-28(50％)和25-28(50％)具有部分活性。Ho等(Thymus，1987，977-84)報道C-端片段13-19與Tα1具有相同的促T細胞增殖活性，20-25和20-28具有部分活性。Ciaredelli等(Biochemistry，1982，214233-4237)用硫唑呤抑制E-玫瑰花結(jié)形成試驗發(fā)現(xiàn)C-端17-28區(qū)域部分片段有較好的活性，其中20-25和20-27活性與Tα1相當，17-24活性略高于Tα1。Abiko等(Biotechnol Ther，1992，3159-68)以Phe和Phe(4-F)替代Tα1序列中21位的Glu合成了[Phe21]-desAc-Tα1和[Phe(4-F)21]-desAc-Tα1，E-玫瑰花結(jié)形成試驗顯示[Phe(4-F)21]-desAc-Tα1比[Phe21]-desAc-Tα1活性高，[Phe21]-desAc-Tα1與desAc-Tα1活性相當。
Grottesi等(Peptides，1998，191731-8)通過圓二色譜和二維核磁對Tα1在溶液中的構(gòu)象進行了研究。結(jié)果表明，Tα1在水溶液中并不形成優(yōu)勢的二級構(gòu)象，但在疏水環(huán)境中能形成一定的二級結(jié)構(gòu)。在40％的三氟乙醇水溶液中，Val5和Glu8之間形成β-轉(zhuǎn)角，Lys17和Glu24之間形成α-螺旋。鑒于Tα1受體結(jié)構(gòu)還未被發(fā)現(xiàn)，Grottesi等認為Tα1與淋巴細胞的作用可能是Tα1首先通過極性氨基酸殘基與細胞膜形成靜電作用，然后誘導(dǎo)Tα1的Lys17至Glu24之間序列形成α螺旋結(jié)構(gòu)并嵌入細胞膜，進而與IL-2受體跨膜區(qū)發(fā)生靜電作用。這一作用模型有助于解釋Tα1與IL-2的協(xié)同作用。
病毒性乙型和丙型肝炎，可以導(dǎo)致肝癌和肝硬化，WHO估計目前全球有3.5億乙型肝炎病毒攜帶者和1.7億丙型肝炎病毒攜帶者。乙型肝炎在亞洲尤為流行，我國是肝炎大國。Tα1用于免疫缺陷或免疫受抑制的疾病的臨床治療研究始于20世紀80年代，目前已經(jīng)取得了較好的效果。臨床試驗的總結(jié)分析證明，Tα1單獨或與干擾素聯(lián)合使用治療慢性乙型肝炎是有效的。1996年，美國賽生制藥公司生產(chǎn)的化學(xué)合成胸腺素α1(商品名為日達仙)首先在中國上市，它單獨或與干擾素聯(lián)合使用治療慢性乙型肝炎。至2002年12月，日達仙已在30多個國家獲準銷售。在治療丙型肝炎方面，日達仙與干擾素一起使用是目前最為有效的方法之一。對于許多其它疾病，包括非小細胞肺癌、黑色素瘤和艾滋病，Tα1都有一定的療效。另外，Tα1也可作為疫苗輔助藥加強流感疫苗和乙型肝炎疫苗的效果。
目前臨床使用的Tα1為化學(xué)合成品，價格昂貴、用藥劑量大、周期長。尋找生物活性肽的活性中心是構(gòu)效關(guān)系研究的重要目的之一，因此進行Tα1的構(gòu)效關(guān)系研究，尋找結(jié)構(gòu)簡單并有較好活性的Tα1活性片段仍有意義。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式I化合物或其衍生物具有優(yōu)良的預(yù)防或治療免疫缺陷、免疫功能低下有關(guān)疾病的活性，并且它們與聚乙二醇形成的衍生物在保持固有活性的同時，延長了式(I)化合物的體內(nèi)半衰期，從而降低了式(I)化合物的用量并延長了式(I)化合物的體內(nèi)作用時間。
本發(fā)明第一方面涉及式(I)化合物或其立體異構(gòu)體X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(I)X1為L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y1為L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；X2為L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；
X3為L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y為L-或D-型的天然或非天然芳香性酸基酸，如His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為L-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、GABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z2為L-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Gly、Ala、β-Ala、BABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y2為L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，如Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)等，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；本發(fā)明再一方面涉及式(II)化合物，其為式(I)化合物任意位點的氨基經(jīng)PEG共價修飾的化合物，所述氨基包括N-端氨基或賴氨酸側(cè)鏈氨基，[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(II)
PEG表示RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-4，X1，Y1，X2，X3，Y，Z1，Z2和Y2如式(I)中定義。
本發(fā)明還涉及式(III)化合物，其為式(I)化合物任意位點的羧基經(jīng)PEG共價修飾的化合物，所述羧基包括C-端羧基，天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈的羧基，X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-[CO-X-PEG]z(III)其中，X＝O或NH，z＝1-4，X1，Y1，X2，X3，Y，Z1，Z2和Y2如式(I)中定義。
本發(fā)明還涉及式(IV)化合物，其為式(I)化合物的N-端引入半胱氨酸后經(jīng)PEG-M修飾的化合物PEG-M-Cys-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(IV) Cys為半胱氨酸，它通過其側(cè)鏈硫醚原子與M基團共價相連，Cys還以其羧基與式(I)化合物的N-端氨基形成酰胺鍵相連，X1，X2，X3，Y，Y1，Y2，Z1和Z2如式I中定義。
本發(fā)明所涉及藥物組合物，其包括至少一種式(I)或式(II)或式(III)或(IV)化合物及藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明還涉及至少一種式(I)或式(II)或式(III)或(IV)化合物在制備用于預(yù)防或治療免疫缺陷或免疫低下有關(guān)疾病的藥物中用途，包括在乙肝，丙肝，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及制備式I化合物的方法，其包括，用已知固相或液相合成法合成。
本發(fā)明還涉及式II或式III化合物的制備方法，其包括將在PEG上引入羧基或氨基后與式(I)化合物的中的氨基或羧基的縮合反應(yīng)形成。
根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明中使用的縮寫詞具有下面的含義Tα1胸腺素α1，PEG 聚乙二醇，PEG-MAL-馬來酰亞胺基聚乙二醇，PEG-VS-乙烯砜基聚乙二醇，PEG-IODO-碘代乙酰胺基聚乙二醇，Ala 丙氨酸，Arg 精氨酸，Asn-天冬酰胺，Asp 天冬氨酸，Cys-半胱氨酸，Glu 谷氨酸，Gly 甘氨酸，His 組氨酸，Ile 異亮氨酸，Leu 亮氨酸，Lys 賴氨酸，Mob β-胡椒基丙氨酸，Nal 萘丙氨酸，Phe 苯丙氨酸，Phg 苯基甘氨酸，Pya β-吡啶基丙氨酸，Pro 脯氨酸，Ser-絲氨酸，Thr-蘇氨酸，Trp 色氨酸，Tyr 酪氨酸，Val 纈氨酸，
GABA γ-氨基丁酸，Ac 乙?；?，Boc 叔丁氧羰基，F(xiàn)moc 芴甲氧羰基，DMF 二甲基甲酰胺，DCC 二環(huán)已基碳二亞胺，HOBT 1-羥基苯并三唑，HBTU 2-(1H-1-羥基苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，NMM N-甲基嗎啡啉，TFA 三氟乙酸，Ts-Cl 對甲苯磺酰氯RP-HPLC 反相高效液相色譜。
本發(fā)明中，所有氨基酸構(gòu)型除注明為D-型外，均為L-型。
根據(jù)本發(fā)明，式I化合物優(yōu)選X1為Lys；Y1為Glu；X2為Lys；X3為Lys；Y為L-或D-型Phe(X)，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
根據(jù)本發(fā)明，式II化合物優(yōu)選z＝1；X1為Lys；Y1為Glu；X2為Lys；X3為Lys；Y為Glu、L-或D-型Phe(R)，R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
本發(fā)明所用的PEG-OH結(jié)構(gòu)為RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，R＝H或CH3，n＝5-1000。平均分子量由幾百到幾萬的PEG-OH可作為商品化試劑購買到，PEG-NH2可以購買或通過以下反應(yīng)得到先將其轉(zhuǎn)化為PEG-NH2，再與琥珀酸酐反應(yīng)得到PEG-NHCOCH2CH2COOH，然后將此化合物可作為羧基組分，可在固相上將其偶聯(lián)到多肽的N-端，最后經(jīng)三氟乙酸裂解和反相高效液相色譜純化得產(chǎn)物。
在PEG的一端先引入氨基、羧基或制備PEG化修飾的氨基酸(如Fmoc-Lys(NH-COCH2-PEG)-OH、Fmoc-Glu(CO-NH-PEG)-OH Fmoc-Asp(CO-NH-PEG)-OH)，再用液相或固相法偶聯(lián)到肽序列中去，可實現(xiàn)對多肽的N-端氨基、C-端羧基、Lys側(cè)鏈氨基、Asp或Glu側(cè)鏈羧基的修飾。
將PEG-NH2分別與馬來酸酐、乙烯基氯化亞砜、碘代乙酸酐反應(yīng)得PEG-MAL、PEG-VS和PEG-IODO。PEG-MAL通過以下反應(yīng)得到 Tα1(17-24)的活性片段可用固相或液相多肽合成法合成，在合成過程中很容易在N-端或C-端引入一個Cys。將含Cys的肽鏈溶于水中，用碳酸氫鈉調(diào)pH 7-8，加入3倍當量的PEG-MAL或PEG-MAL或PEG-VS和PEG-IODO室溫攪拌反應(yīng)，用反相高效液相色譜純化得PEG修飾的Tα1的活性片段。PEG-MAL修飾Cys-Tα1(17-24)的反應(yīng)如下 本發(fā)明涉及的Wang樹脂、DCC、HOBT、HBTU、NMM、TFA和普通Fmoc-氨基酸通過購買獲得，下列非天然氨基酸由發(fā)明人合成并拆分Phe(4-F)，Phe(3-F)，Phe(2-F)，Phe(4-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(3-Cl)，Phe(2-Cl)，Phe(4-Br)，Phe(3-NO2，Phe(2，5-Cl2，Phe(4-F，3-Cl)，Mob，D-Phe，D-Phe(4-F)，D-Phe(3-F)，D-Phe(2-F)，D-Phe(3-Cl)，D-Phe(2-Cl)，D-Phe(4-Br)，D-Phe(3-NO2)，D-Phe(2，5-Cl2)，D-Phe(4-F，3-Cl)，D-Mob。
本發(fā)明合成的系列八肽衍生物是基于Tα1(17-24)的新結(jié)構(gòu)的Tα1活性片段及其聚乙二醇化衍生物，通過初步活性評價觀察到部分化合物具有較好的體外促小鼠淋巴細胞增殖的生物活性。含它們的藥物組合物可用于免疫缺陷、免疫功能低下等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防。Tα1活性八肽衍生物可與一種或多種賦形劑結(jié)合制成適用于人的劑型，如用甘露醇作賦形劑制成注射劑，經(jīng)皮下給藥治療免疫缺陷、免疫功能低下等相關(guān)疾病，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，式I化合物優(yōu)選下面的化合物[Phe21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)[Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)
-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)。
根據(jù)本發(fā)明，式II化合物優(yōu)選下面的化合物PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F)21]Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(3-F)21]Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mCO-[Phe(2-F)21]Tα1(17-24)PEG-CH2CH2-X-(CH2)mOO-[Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24)X＝O、NH或NHCO；m＝0-6。
根據(jù)本發(fā)明，與免疫缺陷或免疫功能低下有關(guān)的疾病舉例有乙型肝炎，丙型肝炎，非小細胞肺癌，黑色素瘤或艾滋病，冠狀病毒引起的SARS。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用術(shù)語“Tα1(17-24)序列是指Tα1的17位-24位的氨基酸序列。
具體實施方式實施例下述實施例代表本發(fā)明的說明性實施方案，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。
實施例所用固相合成載體Wang樹脂為ACT產(chǎn)品，DCC、HOBT、HBTU、Fmoc-保護氨基酸為上海吉爾生化產(chǎn)品，TFA為ACROS產(chǎn)品，平均分子量為2000的mPEG-OH為Sigma產(chǎn)品。
實施例1 Phe(4-F)21Tα1(17-24)的合成將0.285g H-Phe(4-F)-OH.HCl(1.3mmol)溶于10mL甲醇、10mL丙酮和10mL水中，加入0.218g NaHCO3(2.6mm0l)，攪拌使固體溶解后再加入等0.438g Fmoc-OSu(1.3mmol)，室溫攪拌反應(yīng)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，用6N鹽酸調(diào)pH 2-3，乙酸乙酯提取水相3次，合并有機相，無水MgSO4干燥。濾除干燥劑，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得白色固體。再以乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶得0.320g Fmoc-Phe(4-F)-OH，收率61.5％。
以100mg Wang樹脂(0.05mmol)為固相載體，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH為原料，DCC-HOBT作縮合劑，根據(jù)Tα1(17-24)的氨基酸序列，在21位以Fmoc-Phe(4-F)-OH代替Fmoc-Glu(OtBu)-OH，按標準的Fmoc固相多肽合成方法操作合成H-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe(4-F)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂。
將5ml裂解液(4.5ml TFA，0.5ml間甲酚)冷卻至0℃，加入上述合成的肽樹脂反應(yīng)90分鐘。濾除樹脂并用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加入無水乙醚沉淀出固體。濾集固體，溶于水，冰凍干燥后得粗品肽27.0mg，HPLC純化得純品9.3mg。FAB-MS1024.8(理論值1024.2)。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時)的氨基酸組成比例分析與理論值相符Glu，2.37(2)；Val，1.61(2)；Lys，3.02(3)。
實施2 mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24)的合成稱取mPEG2000OH 20g(10mmol)置于250ml反應(yīng)瓶中，加入50mlCH2Cl2，固體溶解后再加入7.5ml Et3N(50mmmol)和9.5g Ts-Cl(50mmol)，室溫攪拌反應(yīng)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加100ml無水乙醚沉淀出固體，得18.9g mPEG2000-OTs，收率94％將12g mPEG2000-OTs(6mmol)溶于30ml DMF，加入3.36g(18mmol)鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽，120℃反應(yīng)4小時。減壓蒸去溶劑，將殘余物溶于50ml無水乙醇，加入4.0ml水合肼，回流反應(yīng)4小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘余物溶于CH2Cl2，濾去不溶物，再將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用無水乙醚沉淀出固體，再以無水乙醇-乙醚重結(jié)晶，得10.9g mPEG2000-NH2，收率90％。
將6.3g mPEG2000-NH2溶于20ml DMF中，加入0.45g琥珀酸酐，40℃反應(yīng)0.5小時，減壓蒸去溶劑，加無水乙醚沉淀出固體，得4.7gmPEG2000-NHCOCH2CH2COOH，收率74％。
以100mg Wang樹脂(0.05mmol)為固相載體，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH為原料，DCC-HOBT作縮合劑，根據(jù)Tα1(17-24)的氨基酸序列，按標準的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂，加入mPEG2000-NHCOCH2CH2COOH(0.1mmol)，HBTU(0.1mmol)，NMM(0.15mmol)，反應(yīng)48小時后，茚三酮法檢測為陰性，停止反應(yīng)，將所得肽樹脂洗滌干燥。以5ml TFA為裂解試劑，0℃反應(yīng)90分鐘，濾除樹脂，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加無水乙醚沉淀出固體，濾集固體，溶于水中，冰凍干燥得白色粘稠固體60mg。HPLC純化得目標產(chǎn)物。
mPEG2000-NHCOCH2CH2CO-Tα1(17-24)經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，在3127附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時)的氨基酸組成比例分析與理論值相符Glu，2.37(2)；Val，1.61(2)；Lys，3.02(3)。
實施3 Cys(mPEG2000-MAL)-Tα1(17-24)的合成將1.0g mPEG2000-NH2溶于10ml二氧六環(huán)，加入馬來酸酐0.4g，80℃攪拌反應(yīng)30min。減壓蒸去溶劑，加入50ml無水乙醚，冷卻沉淀出固體，濾集固體，干燥后得0.95g。將所得固體溶于15ml乙酸酐，加入1.0g乙酸鈉，100℃攪拌反應(yīng)45min。減壓蒸去溶劑，將殘余物用二氯甲烷溶解，濾去不溶物，向濾液中加入適量活性炭，放置30min，濾除活性炭，將濾液濃縮至干，加入無水乙醚，沉淀出固體，濾集、干燥后得淺黃色固體0.55g mPEG2000-MAL，收率55％。
以100mg Wang樹脂(0.05mmol)為固相載體，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH為原料，DCC-HOBT作縮合劑，根據(jù)Tα1(17-24)的氨基酸序列，按標準的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Wang樹脂。以EDT-間甲酚-TFA作裂解液，0℃反應(yīng)90分鐘，濾除樹脂，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加無水乙醚沉淀出白色固體，濾集固體，溶于水中，冰凍干燥得白色干粉37mg。RP-HPLC純化，F(xiàn)AB-MS分析，M+1峰1092(理論值1091)。
將經(jīng)RP-HPLC純化后的Cys-Tα1(17-24)溶于水中，以碳酸氫鈉調(diào)pH至7-8，加入3倍當量的mPEG2000-MAL，室溫反應(yīng)，用RP HPLC監(jiān)測反應(yīng)進程和分離產(chǎn)物。
Cys(mPEG2000-MAL)-Tα1(17-24)經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，在3096附近有一系列峰，相鄰兩峰分子量相差約44，具有聚乙二醇的典型結(jié)構(gòu)特征。酸水解(6N鹽酸水溶液，110℃，22小時)的氨基酸組成比例分析與理論值相符Glu，3.36(3)；Val，1.50(2)；Lys，3.14(3)。
實施例43H-TdR摻入法檢測對小鼠脾淋巴細胞的增殖反應(yīng)斷頭放血處死小鼠，無菌條件下迅速取出脾臟，放入RPMI1640液中。將脾臟放在100目不銹鋼網(wǎng)上或尼龍網(wǎng)中用針芯或三角玻棒研磨，制成脾細胞懸液。用培養(yǎng)液離心洗滌脾細胞一次后，加入Tris-NH4Cl緩沖液(0.16M NH4Cl和0.17M Tris按9∶1混合，pH 7.2)作用3-5分鐘，溶解RBC，再用培養(yǎng)液離心洗滌兩次。用苔盼藍染色，活細胞數(shù)需在95％以上。用20％小牛血清1640液將細胞稀釋成5-10×106個/mL濃度備用。將脾細胞加入無菌96孔培養(yǎng)板中，5-10×105個/100μL/孔，再加入Con A 50μL/孔(終濃度O.5μg/mL)，37 C孵溫6小時。加入不同濃度待測樣品50μL/孔，置5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)66小時。終止培養(yǎng)前16小時，每孔加入3H-TdR 20μL，使其終濃度為1μci(37KBq)/mL。用TOMTEC公司Harvester96型96孔板細胞收集儀收集細胞樣本于型玻璃纖維濾紙片上，置80 C烘箱內(nèi)干燥30分鐘或自然干燥。將干燥的濾紙片放入盛有閃爍液的小瓶中，用PerkinElmer公司的MicoBeta Trilux 1450型微量液閃儀檢測cpm值。液閃儀每分鐘記錄的脈沖數(shù)(cpm)表示試驗結(jié)果。
注n＝3，*，**，***表示與CON比較P＜0.05，＜0.01，＜0.001實施例5 Tα1活性片段的體外抗SARS病毒實驗生長成片的96孔塑膠板培養(yǎng)的Vero E6細胞，傾出培養(yǎng)液后，加入100TCID50的SARS病毒，吸附2小時，傾出病毒，加入待測樣品，終濃度為100μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)7天，每天在顯微鏡下觀察Vero E6細胞病變程度，結(jié)果如下
注4-/4表示4個孔都無病毒繁殖，即陰性；4+/4表示4個孔均為陽性。
結(jié)論Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24)在100μg/ml時有體外抗SARS病毒活性。
權(quán)利要求
1.具有式(I)結(jié)構(gòu)的八肽衍生物或其立體異構(gòu)體X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(I)X1為選自Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Y1為選自Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；X2為選自Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；X3為選自Arg、Lys、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然堿性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Y為選自His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然芳香性酸基酸，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Z1為選自Gly、Ala、β-Ala、GABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Z2為選自Gly、Ala、β-Ala、BABA、Val、Leu、Ile、Pro、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的中性或親脂性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Y2為選自Asp、Glu、His、Tyr、Trp、Mob、Nal、Pya、Phe(X)、Phg(X)的L-或D-型的天然或非天然酸性或芳香性氨基酸及其衍生物，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物X1為Lys；Y1為Glu；X2為Lys；X3為Lys；Y為L-或D-型Phe(X)，其中X為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，取代基選自H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的化合物，其中所述化合物下列八肽衍生物[Phe21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)[Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)[Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-F)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2-Cl)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-Br)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(3-NO2)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(2，5-Cl2)21]-Tα1(17-24)[D-Phe(4-F，3-Cl)21]-Tα1(17-24)
4.式(I)結(jié)構(gòu)中任意位點的氨基經(jīng)PEG共價修飾的化合物(II)，其中所述氨基包括N-端氨基和賴氨酸側(cè)鏈氨基[PEG-X-(CH2)mCO-NH]z-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(II)PEG表示RO(CH2CH2O)n-CH2CH2，R＝H或CH3，n＝5-1000；X＝O、NH或NHCO；m＝0-6；z＝1-4；X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求
1。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的化合物，z＝1；X1為Lys；Y1為Glu；X2為Lys；X3為Lys；Y為Glu、L-或D-型Phe(R)，R為氫、鹵素、硝基、羧基或C1-C4烷基單取代或二取代，如H、4-F、3-F、2-F、4-Cl、3-Cl、2-Cl、4-Br、3-Br、2-Br、2，5-Cl2、4-F，3-Cl、3-NO2等；Z1為Val；Z2為Val；Y2為Glu。
6.下列化合物選自權(quán)利要求
5的化合物PEG-X-(CH2)mCO-Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F)21]Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(3-F)21]Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(2-F)21]Tα1(17-24)PEG-X-(CH2)mCO-[Phe(4-F，3-Cl)21]Tα1(17-24)X＝O、NH或NHCO；m＝0-6。
7.式(I)結(jié)構(gòu)中任意位點的羧基經(jīng)PEG共價修飾的化合物(III)，其中所述羧基包括C-端羧基、天冬氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈羧基X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-[CO-X-PEG]z(III)X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求
1；X＝O或NH，z＝1-4。
8.式(I)結(jié)構(gòu)化合物的N-端引入半胱氨酸后經(jīng)PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修飾的化合物(IV)PEG-M-Cys-X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2(IV) Cys為半胱氨酸，通過側(cè)鏈硫醚原子與M基團共價相連；X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求
1。
9.式(I)結(jié)構(gòu)化合物的C-端引入半胱氨酸后經(jīng)PEG-MAL、PEG-VS或PEG-IODO修飾的化合物(V)X1-Y1-X2-X3-Y-Z1-Z2-Y2-Cys-M-PEG(V)X1、Y1、X2、X3、Y、Z1、Z2、Y2的定義同權(quán)利要求
1；M的定義同權(quán)利要求
8。
10.權(quán)利要求
1-9中任一化合物在制備用于治療或預(yù)防免疫缺陷、免疫功能低下等相關(guān)疾病，乙型肝炎，丙型肝炎，惡性黑色素瘤，非小細胞性肺癌，冠狀病毒引起的SARS等相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及以天然或非天然氨基酸取代的胸腺素α
文檔編號A61P31/14GK1990037SQ200610152723
公開日2007年7月4日 申請日期2003年5月16日
發(fā)明者劉克良, 王良友, 梁遠軍, 吳萍, 許笑宇, 劉尚義, 齊春會, 趙修南 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan