專利名稱:仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是基因工程制品的制作方法，具體地說是利用定點(diǎn)突變和同源重組技術(shù)對(duì)編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因進(jìn)行改造的方法。
背景技術(shù)：
仔豬水腫病是斷奶仔豬常發(fā)的一種細(xì)菌性傳染病，本病發(fā)病率不高，但死亡率很高，尤其是對(duì)健康狀況好的仔豬發(fā)病較多，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失，但目前市場(chǎng)上的水腫疫苗仍是以常規(guī)滅活疫苗為主。因在疫苗的滅活過程中常常會(huì)影響疫苗的免疫原從而使疫苗的免疫保護(hù)性降低。因此，研制更加安全有效的疫苗成為目前十分迫切的需要。
(三)發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種利用定點(diǎn)突變及同源重組技術(shù)構(gòu)建仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的類志賀氏毒素II型變異體是由SLT-IIe基因編碼，該基因含有1236個(gè)堿基，編碼410個(gè)氨基酸殘基，其167位的谷氨酸和170位的精氨酸兩個(gè)氨基酸是整個(gè)基因的活性部位，分別突變?yōu)楣劝滨０泛土涟彼岷?，突變體失去了原基因的致病性而保留了其免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。
仔豬水腫病大腸桿菌(0139)SLT-IIe基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列為
1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1 M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA GAA GCC TTA CGG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A D A L R F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E -961 AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N1021 GCA ATG GCG GCG GAT TGT GCT AAA GGT AAA ATT GAG TTT TCC AAG TAT AAT GAG GAT AAT341 A M A A D C A K G K I E F S K Y N E D N1081 ACC TTT ACT GTG AAG GTG TCA GGA AGA GAA TAC TGG ACG AAC AGA TGG AAT TTG CAG CCA361 T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P
1141 TTG TTA CAA AGT GCT CAG CTG ACA GGG ATG ACT GTA ACA ATC ATA TCT AAT ACC TGC AGT381 L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S1201 TCA GGC TCA GGC TTT GCC CAG GTG AAG TTT AAC TGA401 S G S G F A Q V K F N -突變菌株SLT-IIe*基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列為1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1 M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R II S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA CAG GCC TTA CGG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A G A L I F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E -
961 AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N1021 GCA ATG GCG GCG GAT TGT GCT AAA GGT AAA ATT GAG TTT TCC AAG TAT AAT GAG GAT AAT341 A M A A D C A K G K I E F S K Y N E D N1081 ACC TTT ACT GTG AAG GTG TCA GGA AGA GAA TAC TGG ACG AAC AGA TGG AAT TTG CAG CCA361 T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P1141 TTG TTA CAA AGT GCT CAG CTG ACA GGG ATG ACT GTA ACA ATC ATA TCT AAT ACC TGC AGT381 L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S1201 TCA GGC TCA GGC TTT GCC CAG GTG AAG TTT AAC TGA401 S G S G F A Q V K F N -本發(fā)明的過程是這樣的(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因及其左側(cè)翼序列的特異性引物(L*15’--3，AGT GGT GAG AGC GAG CGA CTCATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCCTTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGC AAA GC)；(2)通過PCR擴(kuò)增獲得編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因及左側(cè)翼基因；(3)對(duì)SLT-IIe基因及左側(cè)翼L-SLT-IIe基因序列進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(4)重新設(shè)計(jì)4對(duì)用于定點(diǎn)突變的特異性引物(L*15’--3’AGT GGT GAGAGC GAG CGA CTC ATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCC TTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTGGGC AAA GC)；(5)通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)含突變點(diǎn)的基因片斷；(6)將兩個(gè)片斷分別進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(7)通過PCR反應(yīng)將兩個(gè)含突變點(diǎn)的基因片斷連接起來；(8)連接后的突變基因SLT-IIe*進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(9)將SLT-IIe*基因亞克隆至自殺質(zhì)粒pCVD442載體上；
(10)重組質(zhì)粒pCVD442::SLT-IIe*轉(zhuǎn)化到SM10λpir大腸桿菌中；(11)誘導(dǎo)仔豬水腫病大腸桿菌(0139)的萘啶酮酸抗性，方法如下接種100μl過夜培養(yǎng)的仔豬水腫病大腸桿菌(0139)到液體LB試管中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入萘啶酮酸至終濃度為20μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。進(jìn)行稀釋后，涂布于含20μg/ml萘啶酮酸的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)單菌落接種于5ml液體LB試管中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再加入萘啶酮酸至終濃度為50μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。進(jìn)行稀釋后，涂布于含50μg/ml萘啶酮酸的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落接種于5ml液體LB培養(yǎng)基中，并加入萘啶酮酸至終濃度為50μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)后保存菌種，此菌株即誘導(dǎo)出了NalR，記為0139(NalR)。
(12)0139(NalR)與含pCVD442::SLT-IIe*質(zhì)粒的SM10λpir大腸桿菌共培養(yǎng)篩選出重組子。
本發(fā)明產(chǎn)生的SLT-IIe*突變大腸桿菌是在成功克隆出SLT-IIe基因的基礎(chǔ)上，利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)SLT-IIe基因的第167和170位氨基酸進(jìn)行突變產(chǎn)生了突變體SLT-IIe*，進(jìn)而經(jīng)過同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了SLT-IIe*突變大腸桿菌新菌株。
利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于作為口服疫苗的候選菌株制備疫苗，防制仔豬水腫病。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在①作為安全的口服疫苗候選菌株，用于仔豬水腫病的防治，與該病自然感染模式相同。
②可在腸道內(nèi)存在，既可刺激機(jī)體產(chǎn)生局部的細(xì)胞免疫又可刺激機(jī)體產(chǎn)生全身的體液免疫。
毒力基因突變后的菌株失去了對(duì)仔豬的致病性，但仍保留免疫原性，因此可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫。與目前使用的滅活疫苗相比，用該菌株制備口服疫苗免疫仔豬，感染途徑與自然感染途徑相同，疫苗菌在腸道定居后能刺激機(jī)體產(chǎn)生局部免疫和全身免疫，能更好地提高免疫保護(hù)率。該突變菌株的構(gòu)建將為仔豬水腫病口服疫苗的研制提供良好的候選菌株。
(四)具體實(shí)施方案(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因及其左側(cè)翼序列的特異性引物(L*15’--3，AGT GGT GAG AGC GAG CGA CTCATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCCTTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGC AAA GC)；(2)通過PCR擴(kuò)增獲得編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因及左側(cè)翼基因；(3)對(duì)SLT-IIe基因及左側(cè)翼L-SLT-IIe基因序列進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(4)重新設(shè)計(jì)4對(duì)用于定點(diǎn)突變的特異性引物(L*15’--3’AGT GGT GAGAGC GAG CGA CTC ATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCC TTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTGGGC AAA GC)；(5)通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)含突變點(diǎn)的基因片斷，將兩個(gè)片斷分別進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(6)通過PCR反應(yīng)將兩個(gè)含突變點(diǎn)的基因片斷連接起來，連接后的突變基因SLT-IIe*進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(7)將SLT-IIe*基因亞克隆至自殺質(zhì)粒pCVD442載體上；(8)重組質(zhì)粒pCVD442::SLT-IIe*轉(zhuǎn)化到SM10λpir大腸桿菌中；
(9)誘導(dǎo)仔豬水腫病大腸桿菌(0139)的萘啶酮酸抗性，方法如下接種100μl過夜培養(yǎng)的仔豬水腫病大腸桿菌(0139)到液體LB試管中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入萘啶酮酸至終濃度為20μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。進(jìn)行稀釋后，涂布于含20μg/ml萘啶酮酸的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)單菌落接種于5ml液體LB試管中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再加入萘啶酮酸至終濃度為50μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。進(jìn)行稀釋后，涂布于含50μg/ml萘啶酮酸的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)菌落接種于5ml液體LB培養(yǎng)基中，并加入萘啶酮酸至終濃度為50μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)后保存菌種，此菌株即誘導(dǎo)出了NalR，記為0139(NalR)。
(10)0139(NalR)與含pCVD442::SLT-IIe*質(zhì)粒的SM10λpir大腸桿菌共培養(yǎng)篩選出重組子。
類志賀氏毒素II型變異體是由SLT-IIe基因編碼，該基因含有1236個(gè)堿基，編碼410個(gè)氨基酸殘基，其167位的谷氨酸和170位的精氨酸兩個(gè)氨基酸是整個(gè)基因的活性部位，分別突變?yōu)楣劝滨０泛土涟彼岷?，突變體失去了原基因的致病性而保留了其免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。
序列表仔豬水腫病大腸桿菌(0139)SLT-IIe基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列為1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1 M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA GAA GCC TTA CGG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A E A L R F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E -961 AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N
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權(quán)利要求
1.一種仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株，其特征是突變后的SLT-IIe*基因特征為完整的SLT-IIe*基因有兩個(gè)開放閱讀框，共1236個(gè)堿基，編碼410個(gè)氨基酸殘基，與野生的仔豬水腫病大腸桿菌0139編碼類志賀氏毒素II型變異體的SLT-IIe僅有3個(gè)堿基的變異，共有2個(gè)氨基酸殘基的變異。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株，其特征是豬大腸桿菌SLT-IIe基因的突變基因SLT-IIe*基因序列為1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1 M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA CGA GCC TTA CTG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A Q A L L F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D R P V I K I N N T L W E S901 AAT ACA GCA GCA GCG TTT CTG AAC AGA AAG TCA CAG TCT TTA TAT ACA ACT GGT GAA TGA301 N T A A A F L N R K S Q S L Y T T G E -961 AAG GAG TTA AGA ATG AAG AAG ATG TTT ATA GCG GTT TTA TTT GCA TTG GTT TCT GTT AAT321 K E L R M K K M F I A V L F A L V S V N1021 GCA ATG GCG GCG GAT TGT GCT AAA GGT AAA ATT GAG TTT TCC AAG TAT AAT GAG GAT AAT341 A M A A D C A K G K I E F S K Y N E D N1081 ACC TTT ACT GTG AAG GTG TCA GGA AGA GAA TAC TGG ACG AAC AGA TGG AAT TTG CAG CCA361 T F T V K V S G R E Y W T N R W N L Q P1141 TTG TTA CAA AGT GCT CAG CTG ACA GGG ATG ACT GTA ACA ATC ATA TCT AAT ACC TGC AGT381 L L Q S A Q L T G M T V T I I S N T C S1201 TCA GGC TCA GGC TTT GCC CAG GTG AAG TTT AAC TGA401 S G S G F A Q V K F N -
3.一種仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株的構(gòu)建方法，其特征為(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因及其左側(cè)翼序列的特異性引物( L*1 5’--3’AGT GGT GAG AGC GAG CGA CTCATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCCTTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGC AAA GC )；(2)通過PCR擴(kuò)增獲得編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因及左側(cè)翼基因；(3)對(duì)SLT-IIe基因及左側(cè)翼L-SLT-IIe基因序列進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(4)重新設(shè)計(jì)4對(duì)用于定點(diǎn)突變的特異性引物(L*15’--3’AGT GGT GAGAGC GAG CGA CTC ATA；L*25’--3’CCT GAACAGTAA GGCCTGTGC TGT G；R*15’--3’A GCACAGGCC TTACTGTTC AGG CAA；R*25’--3’TCA GTT AAA CTT CAC CTG GGCAAA GC )；(5)通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)含突變點(diǎn)的基因片斷，將兩個(gè)片斷分別進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(6)通過PCR反應(yīng)將兩個(gè)含突變點(diǎn)的基因片斷連接起來，連接后的突變基因SLT-IIe*進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；(7)將SLT-IIe*基因亞克隆至自殺質(zhì)粒pCVD442載體上；(8)重組質(zhì)粒pCVD44 2::SLT-IIe*轉(zhuǎn)化到SM10λpir大腸桿菌中；(9)誘導(dǎo)野生0139大腸桿菌的萘啶酮酸抗性，方法如下接種100μl過夜培養(yǎng)的野生0139大腸桿菌到液體LB試管中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入萘啶酮酸至終濃度為20μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，進(jìn)行稀釋后，涂布于含20μg/ml萘啶酮酸的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)單菌落接種于5ml液體LB試管中，37℃振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再加入萘啶酮酸至終濃度為50μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。進(jìn)行稀釋后，涂布于含50μg/ml萘啶酮酸的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落接種于5ml液體LB培養(yǎng)基中，并加入萘啶酮酸至終濃度為50μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)后保存菌種，此菌株即誘導(dǎo)出了NalR，記為0139(NalR)；(10)0139(NalR)與含pCVD442::SLT-IIe*質(zhì)粒的SM10λpir大腸桿菌共培養(yǎng)篩選出重組子。
專利摘要
本發(fā)明提供仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株及其構(gòu)建方法。設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼類志賀氏毒素II型變異體基因及其左側(cè)翼序列的特異性引物；通過PCR擴(kuò)增獲得編碼類志賀氏毒素II型變異體基因及其左側(cè)翼序列，分別進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定；設(shè)計(jì)兩對(duì)針對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變的突變引物；PCR擴(kuò)增兩個(gè)突變片斷，分別克隆、測(cè)序鑒定；利用二重PCR將兩個(gè)突變片斷連接起來，并克隆、測(cè)序鑒定；將突變的基因亞克隆至自殺質(zhì)粒pCVD442中；誘導(dǎo)致水腫病的0139大腸桿菌的萘啶酮酸抗性；利用突變菌株無Amp及蔗糖抗性，而具有萘啶酮酸抗性，并且其基因PCR產(chǎn)物可特異性的被Stu I核酸內(nèi)切酶切開成功篩選出完成同源重組的0139大腸桿菌突變株。可以為仔豬水腫病的常規(guī)預(yù)防提供一種較好的疫苗后備菌株。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1995331SQ200610151213
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2006年12月29日
發(fā)明者師東方, 付海兵 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan