專利名稱：：初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987p-st-f41及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及初生仔豬腹瀉大腸桿菌疫苗的研制，屬于畜牧獸醫(yī)
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景由特定血清型產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic^&c/^n'c/2/aco//，ETEC)引起的初生仔豬腹瀉(Neonataldiarrhea)是導(dǎo)致初生仔豬死亡的一種重要傳染病。初生仔豬腹瀉多表現(xiàn)為突然發(fā)病，拉黃色水樣糞便，迅速脫水和電解質(zhì)失衡。發(fā)病豬可在幾小時(shí)內(nèi)死亡，有的仔豬沒(méi)有出現(xiàn)腹瀉就已經(jīng)死亡。特定血清型的大腸桿菌是引起初生仔豬腹瀉的主要病原，其主要產(chǎn)生F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41四類黏附素，同時(shí)可產(chǎn)生耐熱腸毒素(heat-stableenterotoxin，ST)或/禾口不而寸*冉腸毒素(heat-labileenterotoxin，LT)。鑒于K88、K99、987P、F41四類粘附素在致初生仔豬腹瀉大腸桿菌的高出現(xiàn)率及ST、LT間較高的相關(guān)性，可以認(rèn)定上述六種抗原是致初生仔豬腹瀉ETEC的主要致病因子。在初生仔豬腹瀉防治方面，目前，國(guó)內(nèi)常用的預(yù)防初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗是K88-K99二價(jià)苗，而流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示K88、K99、987P、F41、ST、LT是目前引起我國(guó)初生仔豬腹瀉ETEC的主要毒力因子或保護(hù)性抗原，因此，要有效控制我國(guó)由ETEC引起的初生仔豬腹瀉，應(yīng)注重對(duì)上述全部6種毒力因子的基因工程疫苗的研制。臨床上，可供選擇的另外一種預(yù)防初生仔豬腹瀉的大腸桿菌疫苗是菌體滅活苗，菌體滅活苗需加多個(gè)菌株，即便達(dá)到有限效果，每個(gè)菌株均需達(dá)一定濃度，幾個(gè)菌株加在一起勢(shì)必造成疫苗中細(xì)菌總濃度較高，不可避免地產(chǎn)生副作用，免疫效果有限。因此研制免疫保護(hù)效果好、副作用低的基因工程疫苗為大勢(shì)所趨。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)將上述六種保護(hù)性抗原基因中的三種串聯(lián)表達(dá)的基因工程疫苗產(chǎn)品
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可預(yù)防初生仔豬腹瀉的基因工程疫苗987P-ST-F41。本發(fā)明由987P的主要亞單位基因/fl^片段、ST的主要亞單位基因sto片段、F41的主要亞單位基因/W片段和原核表達(dá)載體pGEX-6P-l串聯(lián)組成。經(jīng)過(guò)一系列免疫保護(hù)試驗(yàn)，證明本發(fā)明對(duì)于預(yù)防初生仔豬腹瀉，是一種高效的初生仔豬腹瀉大腸桿菌基因工程疫苗，安全性和免疫原性可靠。本發(fā)明的第二個(gè)目的還在于發(fā)明一種上述基因工程疫苗987P-ST-F41的構(gòu)建方法將擴(kuò)增出的987P的主要亞單位基因片段、化學(xué)合成ST的主要亞單位基因sto片段、F41的主要亞單位基因片段按987P-ST-F41方式定向串聯(lián)于原核表達(dá)載體pGEX-6P-l。另，用于擴(kuò)增987P的主要亞單位基因/"W片段的引物是PA:GGATCCGCGCCCGCTGAAAACAAPB:CTGCAGCGGTGTACCTGCTGAACGAA用于化學(xué)合成ST的主要亞單位基因sta片段的兩條單鏈DNA是GGTGCTATAAATTGCTACTATTCTGCA用于擴(kuò)增F41的主要亞單位基因片段的引物是PE:AAGCTTGCTGATTGGACGGAAGGTPF:CTCGAGTTAACTATAAATAACGGTGATAGTC勘I本發(fā)明依據(jù)已公開(kāi)的/a"(987P)、sto(ST)、(F41)亞單位的基因序列，設(shè)計(jì)含特異酶切位點(diǎn)的引物；以致初生仔豬腹瀉大腸桿菌的質(zhì)粒或基因組DNA為模板，采用PCR法擴(kuò)增出上述保護(hù)性抗原基因/a"和,7，并化學(xué)合成^to基因；將上述基因定向串聯(lián)于表達(dá)性質(zhì)粒pGEX-6P-l，經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE禾卩Western-blot證明目的基因確已表達(dá)；再將表達(dá)上述3種保護(hù)性抗原基因的重組菌BL21(pFSF41)免疫小鼠，評(píng)價(jià)其免疫原性及安全性。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原987P、ST、F41基因的重組菌，并對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔免疫，結(jié)果顯示經(jīng)重組菌免疫后的小鼠血清中，產(chǎn)生了分別針對(duì)987P、F41抗原特異性的IgG，相應(yīng)的抗體水平從免疫后7天開(kāi)始逐步升高，在第二次免疫后21天左右達(dá)到了較高的水平，并且在攻毒后對(duì)小鼠提供了較好的保護(hù)，針對(duì)987P、F41的標(biāo)準(zhǔn)菌株C83710、C83707的免疫保護(hù)率分別達(dá)83.3%、100%。圖l為本發(fā)明的構(gòu)建模式圖。圖2為GST-FasA-STA-F41聯(lián)合表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果圖。圖3為GST-FasA-STA-F41的Western-blot分析結(jié)果圖。圖4為小鼠免疫后血清中針對(duì)987P抗原特異性IgG檢測(cè)結(jié)果線圖。圖5為小鼠免疫后血清中針對(duì)F41抗原特異性IgG檢測(cè)結(jié)果線圖。具體實(shí)施方式一、生物材料1、保護(hù)性抗原序列3種保護(hù)性抗原的主要亞單位的基因序列來(lái)自于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)的GenBank中，其中①(987P)在GenBank中的登錄號(hào)為M35257,登錄時(shí)間為1993-4-26。②.由(ST)在GenBank中的登錄號(hào)為M18345,登錄時(shí)間為1993-4-26。③(F41)在GenBank中的登錄號(hào)為X14354,登錄時(shí)間為2004-9-9。2、表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒為pGEX-6P-l，購(gòu)自AmershamPharmacia公司。3、菌種的來(lái)源含保護(hù)性抗原基因的重組質(zhì)粒，是在BL21宿主細(xì)菌中表達(dá)的。BL21宿主菌也是商品化宿主菌，也購(gòu)自AmershamPharmacia公司。二、構(gòu)建過(guò)程1、保護(hù)性目的片段的獲得依據(jù)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)的GenBank中這些亞單位的基因序列設(shè)計(jì)出含特異性酶切位點(diǎn)兩對(duì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見(jiàn)表l。表1重組菌987P-ST1-F41的引物基因引物引物序列(5'端-3'端)長(zhǎng)度_________(bp)—~GGATCCGCGCCCGCTGAAAACAA~(987P)5應(yīng)HIPBCTGCAGCGGTGTACCTGCTGAACGAA26iVI(，)AAGCTTGCTGATTGGACGGAAGGTF41州威IPFCTCGAGTTAACTATAAATAACGGTGATAGTC31_^J_化學(xué)合成ST的主要亞單位基因sto片段的兩條單鏈DNA是(兩端分別加卜-~I、歷"dIII限制性酶切位點(diǎn))GGTGCTATAAATTGCTACTATTCTGCA模板DNA的制備按全菌裂解法進(jìn)行。以上述細(xì)菌為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得需要的2個(gè)目的基因片段，/似丄大小分別為520bp和700bp，加為人工合成，大小為57bp，隨后將之連接到pGEM-Teasy載體，分別命名為p/a"、psto和p/W，通過(guò)酶切鑒定及序列測(cè)定，測(cè)序工作由上海聯(lián)合基因公司完成，證明獲得的是正確的片段。2、重組表達(dá)載體pFSF41^0￡乂-6-1-/0^4-5^/^)的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶5amHl、P^I將從載體p/a^切下，因載體pGEX-6P-l的酶切位點(diǎn)沖突，故中間引入克隆載體pBlueScript-SK，將載體pBlueScript-SK以相同的酶切體系進(jìn)行酶切純化回收，將兩種酶切回收片段以適當(dāng)?shù)哪柋冗M(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，經(jīng)酶切分析和鑒定，篩選出pBlueScript-SK/a^陽(yáng)性重組質(zhì)粒。按照上述方法，用限制性內(nèi)切酶尸WI、歷MdIII對(duì)質(zhì)粒psto和pBlueScript-SK-,W酶切，分別回收酶切片段，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，篩選出pBlueScript-SK/a^wto的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。按照上述方法，用限制性內(nèi)切酶///"din、屈01對(duì)質(zhì)粒p//7和pBlueScript-SK-/a^-sto酶切，分別回收酶切片段，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，篩選pBlueScript-SK-/a^4jto-/47(pFSF41)的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶B證HI、屈oI將/c^-虛/W串聯(lián)片段從陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFSF41切下，將質(zhì)粒載體pGEX-6P-1以相同的酶切體系進(jìn)行酶切純化回收，將兩種酶切回收片段以3:1摩爾比進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，經(jīng)酶切分析和鑒定，篩選出pGEX-6P-l-/a^jto-//7的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，含該質(zhì)粒的重組菌命名BL21(pFSF41)，即基因工程苗987P-ST-F41。重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建模式見(jiàn)圖1。三、基因工程苗987P-ST-F41表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE、Western-blot鑒定酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pFSF41轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE(詳見(jiàn)圖2)和Western-blot(詳見(jiàn)圖3)證明目的基因確己表達(dá)。重組質(zhì)粒pFSF41轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在約78kD處出現(xiàn)一特異性蛋白條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致。圖2中1、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)2、pFSF41重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)0.6mmol/LIPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白表達(dá)3、pFSF41重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白表達(dá)4、pGEX-6P-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后GST的表達(dá)產(chǎn)物5、未經(jīng)誘導(dǎo)的pFSF41重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌。圖3中2、樣品為重組菌987P-ST-F41經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物，一抗為987P菌毛的腹水單抗3、樣品為重組菌987P-ST-F41經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物，一抗為F41菌毛的多抗血清。四、基因工程苗987P-ST-F41的免疫效果本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原987P、ST、F41基因的重組菌BL21(pFSF41)，分別制備成油乳劑疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔免疫，結(jié)果顯示經(jīng)重組菌免疫后的小鼠血清中，產(chǎn)生了分別針對(duì)987P、F41抗原特異性的IgG，相應(yīng)的抗體水平從免疫后7天開(kāi)始逐步升高，在第二次免疫后21天左右達(dá)到了較高的水平，說(shuō)明重組菌能夠同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的針對(duì)兩種菌毛保護(hù)性抗原的抗體，并且在攻毒后對(duì)小鼠提供了較好的保護(hù)，針對(duì)987P、F41的標(biāo)準(zhǔn)菌株C83710、C83707的免疫保護(hù)率分別達(dá)83.3%、100%。其對(duì)小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)的分組情況及免疫效果詳見(jiàn)表2。針對(duì)987P抗體變化情況見(jiàn)表3和圖4;針對(duì)F41抗體變化情況見(jiàn)表4和圖5。表2基因工程苗987P-ST-F41免疫試驗(yàn)分組情況及免疫保護(hù)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>免疫保護(hù)率=(攻毒對(duì)照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對(duì)照組死亡率X100。/。表3小鼠免疫基因工程苗987P-ST-F41后血清中針對(duì)987P抗原特異性IgG檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)組小鼠只數(shù)小鼠免疫后血清中針對(duì)987P抗原特異性IgG檢測(cè)值免疫前一免后7天一免后14天二免后7天:免后14大987P-ST-F41滅活苗60.0370.01930.221±0.084a0.293±0.121a1.215±0.161a1.157±0.101a免疫組C837]0齒滅活苗免疫組60.0470.010a0.392±0.169b0.982±0.464b1.143±0.393a1.356±0.085a非免疫對(duì)照組60.0840.739b0.123±0.050c0.084±0.074a0.331±0.215b0.366±0.241b抗體IgG檢測(cè)值二平均抗體檢測(cè)值士標(biāo)準(zhǔn)差，a、b、c有顯著性差異(P〈0.05);顯著性檢驗(yàn)是不同疫苗免疫組以及健康對(duì)照組小鼠在免疫后相同時(shí)刻血清中抗體水平之間的比較。表4小鼠免疫基因工程苗987P-ST-F41后血清中針對(duì)F41抗原特異性IgG檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)組小鼠只數(shù)小鼠免疫后血清中針對(duì)F41抗原特異性IgG檢測(cè)值免疫前-免后7天一免后14天—免后7大:免后14大987P-ST-F41滅活苗免疫組C83707菌滅活苗免疫組非免疫對(duì)照組6一0.172±0.065a0.179±0.075al,183±0.200a1.027±0.206a0.019a0.047±0.017a0.050±0.074b0.539±0.386b0.849±0.357b1.359±0.068b1.327±0.026a0.123±0.125a0.053±0.015a0.186±0.123e0.168±0.040b上述數(shù)據(jù)直觀地說(shuō)明了本發(fā)明涉及的重組菌能夠同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的針對(duì)兩種保護(hù)性抗原的抗體，在攻毒后對(duì)小鼠提供了較好的保護(hù)。本發(fā)明克隆并表達(dá)致初生仔豬腹瀉大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原987P、ST、F41基因，從而研制出相應(yīng)的基因工程疫苗987P-ST-F41。經(jīng)過(guò)一系列免疫保護(hù)試驗(yàn)，證明研制的預(yù)防初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗的高效性。<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>初生仔豬腹瀉病的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41及其構(gòu)建方法<160>6<210>1<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>根據(jù)987P的主要亞單位基因fasA片段設(shè)計(jì)<400>1ggatccgcgcccgctgaaaacaa<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)987P的主要亞單位基因fasA片段設(shè)計(jì)<400>2ctgcagcggtgtacctgctgaacgaa<210>3<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)化學(xué)合成ST的主要亞單位基因sta片段設(shè)計(jì)<400>3gaatagtagcaattactgctgtgaattgtgttgtaatcctgcttgtaccgggtgctata<210>4<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)化學(xué)合成ST的主要亞單位基因sta片段設(shè)計(jì)<400>4agcttatagcacccggtacaagcaggattacaacacaattcacagcagtaattgctactattctgca<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)F41的主要亞單位基因f41片段設(shè)計(jì)<400〉5aagcttgctgattggacggaaggt<210〉6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)F41的主要亞單位基因f41片段設(shè)計(jì)<400>6ctcgagttaactataaataacggtgatagtc權(quán)利要求1、初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41，其特征在于由987P的主要亞單位基因片段、ST的主要亞單位基因sto片段、F41的主要亞單位基因片段和原核表達(dá)載體pGEX-6P-l串聯(lián)組成。2、一種如權(quán)利要求1所述初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41的構(gòu)建方法，其特征在于將擴(kuò)增出的987P的主要亞單位基因/a^片段、化學(xué)合成ST的主要亞單位基因sto片段、F41的主要亞單位基因片段按/"^4-sto-戶7方式定向串聯(lián)于原核表達(dá)載體pGEX-6P-l。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41的構(gòu)建方法，其特征在于用于擴(kuò)增987P的主要亞單位基因/"W片段的引物是PA:GGATCCGCGCCCGCTGAAAACAABamHIPB:CTGCAGCGGTGTACCTGCTGAACGAApSTI4、根據(jù)權(quán)利要求2所述初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41的構(gòu)建方法，其特征在于用于化學(xué)合成ST的主要亞單位基因加片段的兩條單鏈DNA是<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula><formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>5、根據(jù)權(quán)利要求2所述初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41的構(gòu)建方法，其特征在于用于擴(kuò)增F41的主要亞單位基因片段的引物是PE:AAGCTTGCTGATTGGACGGAAGGTHindIIIPF:CTCGAGTTAACTATAAATAACGGTGATAGTCXhoI全文摘要初生仔豬腹瀉的大腸桿菌基因工程疫苗987P-ST-F41及其構(gòu)建方法，屬于畜牧獸醫(yī)
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。將擴(kuò)增出的987P的主要亞單位基因fasA片段、ST的主要亞單位基因sta片段、F41的主要亞單位基因f41片段按fasA-sta-f41方式定向串聯(lián)于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌BL21后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot證明目的基因確已表達(dá)，該疫苗可有效預(yù)防初生仔豬腹瀉，安全性和免疫原性可靠。文檔編號(hào)C12N15/70GK101121936SQ200710023980公開(kāi)日2008年2月13日申請(qǐng)日期2007年7月2日優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日發(fā)明者劉秀梵,馬林艷,崧高申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)