專利名稱:直接的酶凝聚方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了無需酶的預(yù)先分離，而使含有去洗滌型酶的發(fā)酵培養(yǎng)液提取物與適當(dāng)洗滌劑基質(zhì)混合物直接凝聚來制備洗滌劑制劑的方法。
發(fā)明背景現(xiàn)今所用洗滌劑制劑中一般含有酶，例如蛋白酶、脂酶、淀粉酶和纖維素酶，這些酶促使污物分解。要加入酶的洗滌劑基質(zhì)一般包含已知可破壞酶的穩(wěn)定性的化合物，例如堿(如碳酸鈉)和陰離子表面活性劑(如線性烷基苯磺酸鹽)。例如陰離子表面活性劑，已知其會使酶變性。因此，加入到該制劑中的酶在加入前，通常要單獨?；孕纬捎斜坏拿割w粒。包被層一般包含聚合物，如聚乙烯醇、聚乙二醇和/或甲基纖維素，其在凝聚過程中起保護(hù)酶的作用，使其不暴露于堿和陰離子表面活性劑中。
酶以很高的濃度存在于這些顆粒中，因此暴露于來自顆粒的粉塵時可對操作者造成危害。盡管減少粉塵的方法已有報導(dǎo)(如見N.T.Becker等人，美國專利No.5,814,501(Sep 1998)；A.G.J.Hussain，美國專利No.3,773,671(Nov 1973)，但排除酶的單獨分離和?；涂梢耘懦@種危害，同時也提供了更有效的制備方法。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了制備洗滌劑制劑的方法。按照這種方法，提供了流體或優(yōu)選膏狀的含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取物，其中包含(a)洗滌劑型酶和(b)適于摻入到這種洗滌劑制劑中的表面活性劑。提取物隨后與一般也為膏狀的洗滌劑基質(zhì)混合物直接凝聚。
提取物可通過(a)在混合物進(jìn)行分相的條件下，形成含有酶的含水發(fā)酵培養(yǎng)液和洗滌劑型表面活性劑的混合物，和(b)回收含有酶和表面活性劑的相來制備。在一個實施方案中，步驟(a)中的混合物還包括含有金屬陽離子和鹵化物或極性氧化陰離子的鹽。在另一個實施方案中，誘發(fā)分相的條件包括加熱混合物至高于其濁點的溫度。
洗滌劑型表面活性劑優(yōu)選地選自烷基聚醚醇、烷基酚聚醚醇、乙氧基化脂肪醇、高級脂肪酸鏈烷醇酰胺或其烯化氧加合物，及脂肪酸甘油單酯，更優(yōu)選自聚醚醇、烷基酚聚醚醇或乙氧基化脂肪醇。
在隨后的發(fā)明詳述中，本發(fā)明中這些以及其它目的和特征將更明顯。
發(fā)明詳述I.定義下面的術(shù)語除非另有說明，具有如下含意此處所用的“洗滌劑型酶”指可能用于清潔產(chǎn)品，如洗衣洗滌劑、硬表面清潔劑、個人洗護(hù)用品、餐盤洗護(hù)用品等等的任一種酶。這些酶包括，但不限于，蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、內(nèi)切糖苷酶、脂肪酶、過氧化物酶、乳糖酶和過氧化氫酶。特別有用的酶包括堿性蛋白酶，如PURAFECT或PURAFECTOXP(均可從Genencor International，Inc.購買)、SAVINASETM(Novo Industries)、蛋白質(zhì)工程酶如蛋白酶899(Genencor International，Inc.)、DURAZYMTM(在+195和+222位突變的蛋白酶，Novo Nordisk A/S)，及MAXAPEMTM(在+222位突變的蛋白酶，Gistbrocades)；淀粉酶，如SPEZYME(GenencorInternational，Inc.)或蛋白質(zhì)工程淀粉酶如美國專利5,824,532(C.C.Barnett等人，Oct 1998)描述的；纖維素酶或纖維素酶組分，如DENIMEXTM(Novo Nordisk A/S)；及內(nèi)切糖苷酶，如美國專利5,238,843(R.S.Carpenter等人，Aug 1993)和5,258,304(R.S.Carpenter等人，Nov 1993)描述的。
“洗滌劑型表面活性劑”為適于摻入到洗滌劑制劑中，且在此處所述的酶提取中有效的表面活性劑。為了后一目的，應(yīng)使用非離子型表面活性劑。在McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents 1999North American Edition，Vol.1，McCutcheon Div.，MC PublishingCo.，1999，a standard catalog of commercial surfactants，和Schick，M.J(Ed.)，Nonionic surfactants，Marcel Dekker，1987中描述了洗滌劑型表面活性劑。適于用于本發(fā)明方法的表面活性劑包括例如烷基聚醚醇、烷基酚聚醚醇，如TRITONX-100、X-165、X-305或X-405(Rohm&Haas)、ARMUL930(Witcho Corp.)、ALKA SURFNP-15(Rhone Poulenc)、CARSONONN-30(Lonza，Inc.)和CEDEPALCO-730(Stepan Canada，Inc.)；及脂肪醇乙氧基化物，如NEODOL91-6、91-8、23-6.5、25-12、45-13或25-20(Shell)。在此，烷基指的是含有6～20個碳原子、優(yōu)選8～16個碳原子的線狀或分枝狀烴鏈。其它的非離子的洗滌劑型表面活性劑包括高級脂肪酸鏈烷醇酰胺或其烯化氧加合物，和脂肪酸甘油單酯。
“脂肪酸”或“脂肪醇”包括具有至少8個碳原子、優(yōu)選8～24個碳原子的碳鏈，優(yōu)選線狀的碳鏈。
II.酶提取方法許多酶可通過在適當(dāng)條件下，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)某種生物體(酵母、細(xì)菌、真菌)得以大量制備。該生物體經(jīng)培養(yǎng)或發(fā)酵后，產(chǎn)生目的酶，從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收該酶。全發(fā)酵培養(yǎng)液含有位于胞外或胞內(nèi)的酶發(fā)酵產(chǎn)物，還含有細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片(統(tǒng)稱為“細(xì)胞碎片”)，其無需另外步驟即可用于提取。另外，發(fā)酵培養(yǎng)液也可首先通過已知的方法如超濾，去除所有或幾乎所有細(xì)胞碎片而進(jìn)行澄清。使用全發(fā)酵培養(yǎng)液時，提取前可先將培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，以降低培養(yǎng)液中總的固體物質(zhì)的百分比、培養(yǎng)液的粘度和/或傳導(dǎo)性。
已建立了多種針對生物/發(fā)酵產(chǎn)物的回收方法。能摻入至少一種非離子洗滌劑型表面活性劑、使含有表面活性劑和酶的提取物能被回收的方法中的任一種，都可用于本發(fā)明方法中。
一種稱為“親和分配”的從完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片中回收酶的普通方法，在普通溶劑中添加一般為親水性的寡聚物或高聚物和/或鹽(它們在溶液中能產(chǎn)生不溶混的相)的材料時形成多個獨立的相。為了有效分離，要提取的產(chǎn)物對其中一相比另一相更具選擇性的親合力。
例如美國專利No.4,144,130(M.R.Kula等人，Mar 1979)和NO.4,743,550(K.P.Ananthpadmanabhan等人，May 1998)，描述了通過在含有親水性高聚物組合物的含水系統(tǒng)中的分配來分離酶。適當(dāng)?shù)慕M合物，包括PEG(聚乙二醇)與葡聚糖、羥丙基葡聚糖、烷氧基PEG、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉或糖原的組合。
本發(fā)明者已經(jīng)在PCT公開號WO 96/23061(相應(yīng)于專利美國申請08/379,377)中描述了提取疏水性蛋白質(zhì)(其包括許多洗滌劑型蛋白質(zhì))的方法。在該方法中，尤其適于本發(fā)明方法的，將全發(fā)酵培養(yǎng)液或澄清的發(fā)酵培養(yǎng)液與鹽和非離子的洗滌劑型表面活性劑(上文所述)混合以形成二相系統(tǒng)。酶集中于富含表面活性劑的相，而不想要的副產(chǎn)品，如細(xì)胞碎片、次生酶、糖類等等，集中于富含鹽的相。
本方法中使用的鹽，優(yōu)選那些其中陽離子為單價的或二價金屬離子，如鈉、鉀、鎂、銨、鋁或鈣，而其陰離子為極性氧化陰離子，如硫酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、硝酸鹽或檸檬酸鹽，或鹵化物，如氯化物、溴化物或碘化物。也可使用鹽混合物。優(yōu)選的鹽，包括硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉和甲酸鈉。在大約室溫至大約40℃的溫度下將鹽和表面活性劑加入到發(fā)酵培養(yǎng)液(全發(fā)酵培養(yǎng)液或澄清的)。加入鹽和表面活性劑的pH范圍較寬(2～10)，要根據(jù)要回收酶的性質(zhì)而定。在酶不發(fā)生變性或其他降解的前提下，將系統(tǒng)的pH、溫度和壓力保持在最適分離的水平。
加入鹽和表面活性劑后，發(fā)酵培養(yǎng)液一般分為兩相；也可能形成第三種界面間相。通常把任何該界面間相作為包含目的蛋白質(zhì)的頂層相(富含表面活性劑相)的一部分來處理。相分離可通過簡單的混合物靜置，或依照已知方法離心實現(xiàn)。
在另一種稱為濁點萃取的分離方法中，相分離通過提高含有表面活性劑的含水系統(tǒng)的溫度來實現(xiàn)。例如在G.C.Terstappen等人，J.Biotechnology 28263-275(1993)和Terstappen等人，Biotechn.Appl.Biochem.16(3)228-235(1992)中描述的方法，分別使用了聚氧乙烯叔辛基苯基醚(TRITONX-100和X-114)和聚氧乙烯正-十四烷基醚(C14E06，Henkel KGAA)。在一般方法中，向含有蛋白質(zhì)的水性混合物中加入約1％重量/體積的表面活性劑，所得混合物在高于濁點2℃條件下保持2小時，使其發(fā)生相分離。TRITONX-114濁點為28℃，為本方法優(yōu)選的表面活性劑。
IV.將提取物摻入洗滌劑制劑含有洗滌劑型表面活性劑和洗滌劑型酶的提取物，優(yōu)選通過上述方法中的一種獲得的，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的方法包括如離心進(jìn)行收集或回收。然后，將表面活性劑/酶相直接摻入到目的洗滌劑基質(zhì)制劑中。為直接凝聚成固體或膏狀洗滌劑制劑，優(yōu)選進(jìn)行酶的萃取以產(chǎn)生高度粘滯的材料，這一般可通過調(diào)整混合物的濃度或加入的表面活性劑的量來實現(xiàn)。下面實施例3中描述了通過減少表面活性劑的量獲得膏狀提取物的典型方法。
洗滌劑或清潔產(chǎn)品制劑包括，但不限于任何工業(yè)或消費清潔用品，如洗衣用品、硬表面清潔劑、洗衣預(yù)處理用品、餐盤洗護(hù)用品、個人衛(wèi)生用品等等。該制劑一般包括陰離子、陽離子和非離子表面活性劑，也可能包括以下組分，如抗氧化劑、鏈烷醇胺、聚碳酸酯洗滌劑增潔劑，抗再沉積劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、染料、香料、增白劑，等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉可作為清潔成分的不同制劑。例如美國專利4,404,128(Anderson，Sep 1983)、4,261,868(J.Hora等人，Apr 1981)和4,507,219(Hughes，Mar 1985)對這些制劑進(jìn)行了描述，此處引用作為參考。
如下文所述，用枯草桿菌蛋白酶成功進(jìn)行了該直接凝聚方法，而未檢測到酶的降解。該方法具有成本和操作上的優(yōu)勢，免除了酶的單獨?；傲；傅膿胶吞幚淼谋匾Ｓ糜谔幚肀砻婊钚詣└嗟纳唐坊蹌?，可容易地處理酶—表面活性劑膏(或流體)。而且，凝聚的洗滌劑中的酶的濃度比商品化酶顆粒中的酶濃度低10-200倍，因此降低了暴露于致敏的酶粉塵時的風(fēng)險。
不希望受到機(jī)制的限制，可以假定用非離子表面活性劑來提取酶可使其包被或防止化學(xué)攻擊?？紤]到這類提取物的直接凝聚在洗滌劑制劑中的成功應(yīng)用，預(yù)計類似的方法可用于其它制劑方法中，如通常使用單獨?；c包被的蛋白質(zhì)的制藥工業(yè)。
實施例以下實施例只是為了闡述的目的，而不想限制本發(fā)明的范圍。
實施例1和實施例2闡述了發(fā)酵培養(yǎng)液中蛋白酶的鹽/表面活性劑的提取?？捎萌绻灿械腜CT公開No.96/23061中所描述的類似方法進(jìn)行蛋白酶899(使用TRITONX-405)、PURAFECT(使用NEODOL91-6)和LUMAFAST(使用TRITONX-300和X-405)的提取。
實施例1進(jìn)行在枯草芽孢桿菌(B.subtilis)中表達(dá)的蛋白酶2(枯草桿菌蛋白酶，如美國專利5,185,258所述)的發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)液通過生物質(zhì)的絮凝作用，并經(jīng)轉(zhuǎn)動式真空鼓濾器(rotary vacuum drum filter，RVDF)過濾使之澄清。用甲酸將100ml濾出液樣品調(diào)節(jié)至pH7，并加入15克硫酸鈉和10克氯化鈉。將混合物加熱至25℃，并攪拌約1小時使鹽完全溶解。然后加入TRITONX-100(辛基苯酚聚醚醇，Rohm&Hass)(10mL，或初始濾出液體積的10％)，攪拌混合物約15分鐘。通過于大約3000g離心(IEC Centra-P Centrifuge)約15分鐘，使混合物分成兩相(富含表面活性劑的頂層相和富含鹽的底層相)，測定兩相中的枯草桿菌蛋白酶活性。
計算如下參數(shù)分開體積比(volume split)(頂層相體積/底層相體積)為0.2；分配系數(shù)(頂層相中的酶濃度/底層相中的酶濃度)為442；濃度因子(頂層相中的酶濃度/原液中的酶濃度)為4.7，產(chǎn)率(頂層相中回收的總酶量/初始酶量)為93％。
實施例2重復(fù)上面實施例1所述的提取步驟，以10mL NEODOL91-6(乙氧化醇，C9-11；Shell)代替TRITONX-100表面活性劑，得到如下結(jié)果分開體積比為0.22；分配系數(shù)為57；濃度因子為4.66；產(chǎn)率100％。
實施例3本實施例闡述了酶提取物直接凝聚成洗滌劑制劑。
采用實施例2中所述方法制備堿性蛋白酶表面活性劑提取物，不同的是，采用5-10％、優(yōu)選5-7.5％的NEODOL91-6表面活性劑進(jìn)行提取，這樣提取物具有膏的粘稠度。然后將含4％w/w濃度的蛋白酶的膏提取物，和含有陰離子表面活性劑(線形烷基苯磺酸酯、烷基硫酸酯、烷基乙氧基硫酸酯)和非離子表面活性劑(烷基乙氧基化醇)的基質(zhì)洗滌膏混合物一起，加到高度剪切的凝聚劑(如Lodige或Shugi制造的)中。加入提取物一般約為基質(zhì)洗滌劑混合物重量的1％，但可加入該水平的0.1％至10％。
凝聚后，通過以高速操作刀片0.25至10分鐘，以流動的顆粒狀洗滌粉形式，移去含酶的表面活性劑凝聚物。
利用枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行了類似的方法。在高溫和高濕度條件下貯存幾周后，未觀察到酶活性的明顯損失。
盡管本發(fā)明通過參考特定的方法和實施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解在不違背本發(fā)明的情況下可做各種修飾。
權(quán)利要求
1.一種制備洗滌劑制劑的方法，包括1)提供流體或膏狀形式的含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取物，其包括(a)洗滌劑型酶和(b)適于摻入到此類洗滌劑制劑中的表面活性劑，和2)將提取物與洗滌劑基質(zhì)混合物直接凝聚。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中提取物如下制備(a)使含有酶的含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取物和表面活性劑在其進(jìn)行分相的條件下，形成混合物；(b)回收含有酶和表面活性劑的相。
3.權(quán)利要求
2的方法，其中步驟(a)中的混合物還包括含金屬陽離子和鹵化物或極性氧化陰離子的鹽。
4.權(quán)利要求
2的方法，其中的條件包括加熱混合物至高于其濁點的溫度。
5.權(quán)利要求
1的方法，其中表面活性劑選自烷基聚醚醇、烷基酚聚醚醇、乙氧基化脂肪醇、高級脂肪酸鏈烷醇酰胺或它的烯化氧加合物和脂肪酸甘油單酯。
6.權(quán)利要求
5的方法，其中表面活性劑選自烷基聚醚醇、烷基酚聚醚醇和乙氧基化脂肪醇。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中提取物為膏狀。
專利摘要
無需酶的預(yù)先分離，而使含有洗滌劑型酶和非離子洗滌劑型表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)液提取物與適當(dāng)?shù)南礈靹┗|(zhì)混合物直接凝聚制備洗滌劑制劑。
文檔編號C12N9/54GKCN1443234SQ01810796
公開日2003年9月17日 申請日期2001年6月1日
發(fā)明者N·T·拜克爾, E·L·布勞斯特恩, T·P·格雷卡 申請人:金克克國際有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan