專利名稱:一種抗hbv s－表面抗原的單克隆抗體的可變區(qū)及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗乙型肝炎病毒S-表面抗原的單克隆抗體的可變區(qū)及其編碼基因，一個(gè)包含上述基因的重組載體及一個(gè)從上述重組載體獲得的轉(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(以下稱為“HBV”)，原稱丹氏顆粒，具有直徑為42nm的球型特征。其外膜含有大量的乙型肝炎表面抗原，并包被著由180個(gè)乙型肝炎核心蛋白組成的內(nèi)層核殼體。核殼體包含HBV基因組、聚合酶等(Summers等，國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci)，72，4579，1975；Pierre Tiollais等，科學(xué)(Science)，213，406-411，1981)。
在HBV基因組中，HBV表面抗原的編碼區(qū)包括三個(gè)開(kāi)放閱讀框的起始位點(diǎn)，它們使用一個(gè)共同的終止密碼子，產(chǎn)生相同的S區(qū)。因此，HBV表面抗原可分為三種類型，即(1)小型HBV表面抗原(以下稱為“S-表面抗原”)，僅包括S區(qū)，(2)中型HBV表面抗原(以下稱為“M表面抗原”)，包括S區(qū)和另外一個(gè)55個(gè)氨基酸的區(qū)，稱為Pre-S2，及(3)大型HBV表面抗原(以下稱為“L表面抗原”)，包括Pre-S1區(qū)，Pre-S2區(qū)及S區(qū)。在這些表達(dá)的表面抗原中，S-表面抗原占80％或以上。
S-表面抗原的亞型依據(jù)其抗體識(shí)別特征進(jìn)行分類。在所有的表面抗原中均表達(dá)的抗原區(qū)域被分類為a決定簇(determinant a)。其它四種亞型是d或y及w或r。d決定簇在122位殘基處為賴氨酸，而y為精氨酸。類似地，w決定簇在160位殘基處為賴氨酸，而r為精氨酸(Kennedy R.C.等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)130，385，1983)。因此，血清學(xué)型可以被分為四種亞型，例如adr，adw，ayr和ayw(Peterson等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)257，10414，1982；Lars O.Mamius等，Intervirology，38，24-34，1995)。
S-表面抗原可特異地與肝細(xì)胞結(jié)合(Leenders等，肝臟學(xué)(Hepatology)，12，141，1990；Irina Ionescu-Matiu等，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志(J.Med.Virology)，6，175-178，1980；Swan N.T.等，腸胃病學(xué)(Gastroenterology)80，260-264，1981；Swan N.T.等，腸胃病學(xué)(Gastroenterology)，85，466-468，1983；Marie，L.M.等，Proc.Nat.Acad.Sci，81，7708-7712，1984；)。而且已證明人的肝質(zhì)膜含有能與S-表面抗原特異結(jié)合的靶蛋白，如脫輔基脂蛋白H和內(nèi)聯(lián)蛋白II(Mehdi H.等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，68，2415，1994.；Hertogs K.等，病毒學(xué)(Virology)，197，265，1993)。
與此同時(shí)，在開(kāi)發(fā)一種有用的治療性單克隆抗體的過(guò)程中，因?yàn)閺氖笾蝎@得的單克隆抗體在應(yīng)用到人時(shí)會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以人源化抗體是優(yōu)選的。
韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)1999-8650最近已公開(kāi)一個(gè)抗Pre-S1抗原決定部位的單克隆抗體的可變區(qū)，該P(yáng)re-S1僅存在于三種HBV表面抗原(S-，M-和L-表面抗原)中的L表面抗原中，一個(gè)編碼該區(qū)的基因，及一種使用其的人源化抗體。但是，因?yàn)長(zhǎng)表面抗原僅占所表達(dá)的表面抗原的1-2％，所以L表面抗原作為靶來(lái)用于診斷及治療目的抗HBV抗體的研發(fā)是不合適的。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)基本目標(biāo)是提供一種編碼單克隆抗體的可變區(qū)的基因，該可變區(qū)可特異識(shí)別S-表面抗原，特別是能識(shí)別普遍存在于所有HBV表面抗原中的a決定簇。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種包含上述基因的重組載體。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供一種用上述重組載體所獲得的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供上述單克隆抗體的可變區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種編碼特異識(shí)別HBV S-表面抗原的單克隆抗體可變區(qū)的基因。
本發(fā)明人使用S-表面抗原的adr型決定簇(International Enzymes Inc.，美國(guó))免疫小鼠，該型在韓國(guó)HBV患者中最為常見(jiàn)。然后，將從免疫小鼠中獲得的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2O-Ag14，ATCC CRL-1581)融合以產(chǎn)生大量的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)隨后的克隆和選擇程序，最后得到大量的單克隆抗體。本發(fā)明人在大量的單克隆抗體中選擇能特異地與a決定簇結(jié)合的單克隆抗體；從而最終獲得了雜交瘤細(xì)胞系(A9-11-5)，該細(xì)胞系能產(chǎn)生與a決定簇以高親和性特異結(jié)合的特殊的單克隆抗體。
本發(fā)明人從上述雜交瘤細(xì)胞系中分離總RNA，以便合成輕鏈和重鏈的cDNA，并且，最終分別獲得了包括SEQ ID NO.5的大約440bp的輕鏈cDNA基因和包括SEQ ID NO.6的大約460bp的重鏈cDNA基因。
從上述的單克隆抗體的輕鏈和重鏈中，檢測(cè)CDR(互補(bǔ)性決定區(qū))殘基。結(jié)果，確定輕鏈的CDR殘基存在于23-36，52-58及91-98的位置，其分別代表SEQ ID NOs.9，10和11的肽。另外，發(fā)現(xiàn)重鏈的CDR殘基存在于31-35，50-65及98-103的位置，其分別代表SEQ ID NOs.12，13和14的肽。
因此，本發(fā)明，在其范圍內(nèi)，包括一種編碼抗HBV S-表面抗原的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的cDNA，上述輕鏈可變區(qū)包括序列為SEQ ID NOs.9，10和11的肽。另外，本發(fā)明包括一種其中的輕鏈可變區(qū)具有SEQ IDNO.7的氨基酸序列的cDNA，并且優(yōu)選地，包括SEQ ID NO.5的核苷酸序列的cDNA。
而且，本發(fā)明，在其范圍內(nèi)，包括一個(gè)編碼抗HBV S-表面抗原的單克隆抗體重鏈可變區(qū)的cDNA，上述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NOs.12，13和14的肽。另外，本發(fā)明包括一種其中的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列的cDNA，并且優(yōu)選地，包括SEQ ID NO.6的核苷酸序列的cDNA。
上述編碼單克隆抗體的輕鏈或重鏈可變區(qū)的cDNA基因可以插入到質(zhì)粒載體如pCRII(Invitrogen Co.美國(guó))中，得到重組載體。因此，本發(fā)明，在其范圍內(nèi)，包括含有上述編碼輕鏈可變區(qū)的cDNA的重組載體pCRA9Lv，及含有上述編碼重鏈可變區(qū)的cDNA的重組載體pCRA9Hv。
另外，微生物，如大腸桿菌，可以用上述重組載體，pCRA9Lv和/或pCRA9Hv進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化體。因此，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH5α/YRC-pCRA9Lv(KCTC 1011BP)和轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH5α/YRC-pCRA9Hv(KCTC 1010BP)，它們分別是用重組載體pCRA9Lv和pCRA9Hv轉(zhuǎn)化而得到的。
重組載體從上述轉(zhuǎn)化體中用已知方法進(jìn)行回收(J.Sambrook等，Molecular cloning，Vol.1，1.25-1.28)。例如，轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜可用溶液1(50mM葡萄糖，25mM Tris·HCl和10mM EDTA)弱化。用溶液2(0.2NNaOH和1％SDS)破壞細(xì)胞膜，并使蛋白質(zhì)和染色體變性。重組載體之外的成分可用溶液3(5M醋酸鉀和醋酸)聚集，然后離心。獲得的重組載體層可用乙醇沉淀以回收重組載體。
本發(fā)明，在其范圍內(nèi)，包括一種單克隆抗體的可變區(qū)，該區(qū)由包含SEQID NOs.9，10和11的肽的輕鏈和包含SEQ ID NOs.12，13，14的肽的重鏈組成。另外，優(yōu)選的是一種單克隆抗體的可變區(qū)，其中的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列，并且重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
從上述編碼根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)的cDNA基因可獲得人源化的抗HBV的單克隆抗體，其是通過(guò)將S-表面抗原直接結(jié)合的CDR區(qū)(也就是說(shuō)，對(duì)輕鏈來(lái)說(shuō)，編碼SEQ ID Nos.9，10和11的肽的基因；而對(duì)重鏈來(lái)說(shuō)，編碼SEQ ID Nos.12，13和14的肽的基因)與人抗體基因融合，或通過(guò)用編碼本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)的基因替代人抗體可變區(qū)而實(shí)現(xiàn)的。
如上所述，編碼本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)的基因?qū)ψR(shí)別HBV S-表面抗原，尤其是HBV表面抗原中有最高表達(dá)率的a決定簇是特別有效的。因此，本發(fā)明的基因可用于生產(chǎn)廣泛用于各種類型的HBV表面抗原，如adr，adw，ayr和ayw的單克隆抗體，來(lái)中和和/或除去HBV。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1從細(xì)胞系(A9-11-5)中分離RNA及其cDNA合成將1×108個(gè)A9-11-5細(xì)胞加入10ml 4M異硫氰酸胍中破裂細(xì)胞，向其中加入8ml酸性酚溶液。混合物進(jìn)行離心(10000rpm，10分鐘)以提取RNA。向5μg提取的RNA中加入0.5ng寡聚dT，0.5單位的RNA酶抑制劑和100單位莫洛尼鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)。所得的混合物在37℃反應(yīng)1小時(shí)合成cDNA。
用2μg合成的cDNA作為模板；對(duì)輕鏈而言，以SEQ ID Nos.1和2的DNA寡核苷酸作為引物；而對(duì)重鏈而言，以SEQ ID Nos.3和4的DNA寡核苷酸作為引物，用AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer BiosystemCo.，美國(guó))進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在PCR的第一步中，反應(yīng)在以下的條件下94℃ 1.5分鐘，55℃ 2分鐘，和72℃ 3分鐘，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。在第二步中，反應(yīng)在94℃ 1.5分鐘，55℃ 2分鐘及72℃ 10分鐘的條件下進(jìn)行一個(gè)循環(huán)。
將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用100ml 0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色20分鐘后，較之于100bp標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder(Lifetechnology Co.美國(guó))，重鏈的擴(kuò)增的基因產(chǎn)物表現(xiàn)為大約460bp，而輕鏈為大約440bp。實(shí)施例2 cDNA克隆在實(shí)施例1中進(jìn)行1.5％的瓊脂糖電泳后，用透析膜(Spectrum Co.美國(guó))回收440bp的基因片段(輕鏈基因片段)，通過(guò)向其中加入200μl酚和200μl氯仿，除去雜質(zhì)，然后加入2.5ml的乙醇純化該基因片段。將純化的基因片段亞克隆到pCRII載體(Invitrogen Co.，美國(guó))，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Lifetechnology Co.美國(guó))，得到轉(zhuǎn)化體(Cohen，S.N.等，Proc.Nat.Acad.Sci.69，2110，1972)。獲得的轉(zhuǎn)化體在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI(Biolab Co.美國(guó))進(jìn)行酶切，得到插入了上述440bp基因片段的克隆子Lv-1，Lv-4和Lv-7。
對(duì)460bp的基因片段(重鏈基因片段)進(jìn)行同樣的操作，得到重組載體，通過(guò)用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Lifetechnology Co.美國(guó))得到轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI(Biolab Co.美國(guó))進(jìn)行酶切，得到插入上述460bp基因片段的克隆子Hv-1，Hv-4和Hv-7。
向從上述克隆中所獲得的100μg/ml的每種質(zhì)粒溶液中加入60μl聚乙二醇溶液(20％聚乙二醇及2.5M氯化鈉)，然后離心。向所得的沉淀中加入100μl蒸餾水，用50μl酚溶液抽提兩次，然后用200μl乙醇純化質(zhì)粒。
向50μl含有2μg純化的質(zhì)粒的溶液中加入5μl 2N的氫氧化鈉和10μl 10mM EDTA。然后，混合物在37℃反應(yīng)30分鐘。向反應(yīng)混合物分別加入1pmol M13和T7引物。整個(gè)反應(yīng)物在65℃反應(yīng)2分鐘，然后室溫靜置。每個(gè)克隆的核苷酸序列用DNA測(cè)序酶試劑盒II(DNA sequenaseversion II kit)(United States Biochemical Co.，美國(guó))進(jìn)行分析。
結(jié)果表明，三個(gè)輕鏈克隆(Lv-1，Lv-4和Lv-7)的核苷酸序列是相同的。從這些克隆中獲得的質(zhì)粒載體命名為pCRA9Lv。而攜帶pCRA9Lv質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化體被命名為大腸桿菌DH5α/YRC-pCRA9Lv，該菌株最初于2000年5月16日保存在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所中的韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(Korean Collection for Type Cultures(KCTC)in Korea Research Institute of Biosci.& Biotech.)(KCTC18021P)，并且然后于2001年5月16日轉(zhuǎn)為在布達(dá)佩斯條約下的保藏(KCTC 1011BP)。
此外，三個(gè)重鏈克隆(Hv-1，Hv-4和Hv-7)的核苷酸序列是相同的。從這些克隆中獲得的質(zhì)粒載體被命名為pCRA9Hv。而攜帶pCRA9Hv質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化體被命名為大腸桿菌DH5α/YRC-pCRA9Hv，該菌株最初于2000年5月16日保存在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所中的韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(KCTC 18020P)，然后于2001年5月16日轉(zhuǎn)為在布達(dá)佩斯條約下的保藏(KCTC 1010BP)。實(shí)施例3 cDNA的核苷酸序列分析對(duì)從細(xì)胞系A(chǔ)9-11-5獲得的單克隆抗體的可變區(qū)氨基酸序列(Harris.L.等，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci.)4，306-310，1995.；Kabat.E.A.等，免疫學(xué)目的的蛋白質(zhì)的測(cè)序(Sequence of proteins of immunological interest)第五版，1991.；Williams A.F.等，免疫學(xué)年度綜述(Annu.Rev.Immunol.)6，381-406，1988)的分析的結(jié)果表明，該重鏈屬于I(B)亞型(subgroup)，而輕鏈屬于λ1系列。
在可變區(qū)中，重鏈的抗原識(shí)別CDR殘基在31-35(CDR1)，50-65(CDR2)和98-103(CDR3)的位置，而輕鏈的抗原識(shí)別CDR殘基在23-36(CDR1)，52-58(CDR2)和91-98(CDR3)的位置。實(shí)施例4 從雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)9-11-5獲得的單克隆抗體的結(jié)合親和性將從細(xì)胞系A(chǔ)9-11-5獲得的2.0×10-11M的單克隆抗體加入到各種濃度(1.0×10-6-1.2×10-12M)的HBV S-表面抗原(International Enzymes Inc.，美國(guó))溶液中，然后，混合物在室溫下反應(yīng)3小時(shí)。
將100μl每種混合物加入到用0.1μg上述的S-表面抗原預(yù)先包被的96孔酶聯(lián)免疫板(immulon plates)(Dinatech Co.，美國(guó))中?；旌衔镌?7℃溫育2小時(shí)，除去上清。然后，向每孔中加入200μl 0.5％酪蛋白-磷酸鹽緩沖鹽水，并且再在37℃溫育1小時(shí)。加入100μl結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶的稀釋的(×1000)羊抗鼠多克隆抗體(Sigma Co.，美國(guó))，然后用ELISA閱讀儀(reader)(Dinatech Co.，美國(guó))測(cè)定其光密度。
從細(xì)胞系A(chǔ)9-11-5中獲得的單克隆抗體具有1.84×10-9M-1的高結(jié)合親和性。術(shù)語(yǔ)結(jié)合親和性是指當(dāng)50％的單克隆抗體結(jié)合受抑制時(shí)，抗原濃度的倒數(shù)(Friguet B.等，免疫學(xué)方法雜志(J.of Immunological Method)，77，305-319，1985)。
本發(fā)明已參照具體的實(shí)施方式進(jìn)行了描述，應(yīng)該意識(shí)到由那些在本發(fā)明領(lǐng)域中技術(shù)人員可以進(jìn)行各種改進(jìn)和變化，而這些改進(jìn)和變化也在所附加的權(quán)利要求
所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
序列表<110>株式會(huì)社柳韓詳行<120>一種抗HBV S-表面抗原的單克隆抗體的可變區(qū)及其編碼基因<130>YHK200005<150>KR10-2000-0028938<151>2000-05-29<160>14<170>KOPATIN 1.71<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gggaattcat ggcctggatt tcactcttcc tcct 34<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cccaagctta gctcctcagt ggagggtggg aa 32<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3actagtcgac atggctgtct tagggctgct cctctg 36<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4cccaagcttc caggggccag gggatagacg gatgg 35<210>5<211>327<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actaataact ttgccaactg ggtccaagaa 120aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtgatacca acaaccgagt tccgggtgtt 180cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240cagactgaag atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acaacaactg ggtgttcggt 300ggaggaacca aactgactgt cctaggc 327<210>6<211>342<212>DNA<213>大腸桿菌<400>6caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60acctgcacag tctctggttt ctcattaagt acctatggtg tacagtgggt tcgccagtct 120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180gcagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagaacca agttttcttt 240aaagtgaaca gtctgcaagc tgatgacaca gccatatatt attgtgccag agcacggtac 300ttcgatgtct ggggcgctgg gaccacggtc accgtctcct ca 342<210>7<211>109<212>PRT<213>大腸桿菌<400>7Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn20 25 30Asn Phe Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly35 40 45Leu Ile Gly Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala65 70 75 80Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn85 90 95Trp Val Phe Gly Gly Gly ThrLys Leu Thr Val Leu Gly100 105<210>8<211>114<212>PRT<213>大腸桿菌<400>8Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr20 25 30Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Phe65 70 75 80Lys Val Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Ala Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val100 105 110Ser Ser<210>9<211>14<212>PRT<213>大腸桿菌<400>9Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn Asn Phe Ala Asn1 5 10<210>10<211>7<212>PRT<213>大腸桿菌<400>10Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>大腸桿菌<400>11Ala Leu Trp Tyr Asn Asn Trp Val1 5<210>12<211>5<212>PRT<213>大腸桿菌<400>12Thr Tyr Gly Val Gln1 5<210>13<211>16<212>PRT<213>大腸桿菌<400>13Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser1 5 10 15<210>14<211>6<212>PRT<213>大腸桿菌<400>14Ala Arg Tyr Phe Asp Val1 5國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約物材料國(guó)際保藏證明根據(jù)7.1條


國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約物材料國(guó)際保藏證明根據(jù)7.1條


序列表<110>株式會(huì)社 柳韓洋行<120>一種抗HBV S-表面抗原的單克隆抗體的可變區(qū)及其編碼基因<130>YHK200005<160>14<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gggaattcat ggcctggatt tcactcttcc tcct 34<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cccaagctta gctcctcagt ggagggtggg aa 32<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3actagtcgac atggctgtct tagggctgct cctctg 36<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4cccaagcttc caggggccag gggatagacg gatgg 35<210>5<211>327<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actaataact ttgccaactg ggtccaagaa 120aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtgatacca acaaccgagt tccgggtgtt 180cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240cagactgaag atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acaacaactg ggtgttcggt 300ggaggaacca aactgactgt cctaggc 327<210>6<211>342<212>DNA<213>大腸桿菌<400>6caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60acctgcacag tctctggttt ctcattaagt acctatggtg tacagtgggt tcgccagtct 120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180gcagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagaacca agttttcttt 240aaagtgaaca gtctgcaagc tgatgacaca gccatatatt attgtgccag agcacggtac 300ttcgatgtct ggggcgctgg gaccacggtc accgtctcct ca 342<210>7<211>109<212>PRT<213>大腸桿菌<400>7Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn20 25 30Asn Phe Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly35 40 45Leu Ile Gly Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala65 70 75 80Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn85 90 95Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105<210>8<211>114<212>PRT<213>大腸桿菌<400>8Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr20 25 30Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile50 55 60Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Phe65 70 75 80Lys Val Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Ala Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val100 105 110Ser Ser<210>9<211>14<212>PRT<213>大腸桿菌<400>9Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn Asn Phe Ala Asn1 5 10<210>10<211>7<212>PRT<213>大腸桿菌<400>10Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro1 5<210>11<211>8<212>PRT<213>大腸桿菌<400>11Ala Leu Trp Tyr Asn Asn Trp Val1 5<210>12<211>5<212>PRT<213>腸桿菌<400>12Thr Tyr Gly Val Gln1 5<210>13<211>16<212>PRT<213>大腸桿菌<400>13Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser1 5 10 15<210>14<211>6<212> PRT<213>大腸桿菌<400>14Ala Arg Tyr Phe Asp Val1 5
權(quán)利要求
1.一種編碼抗乙型肝炎病毒S-表面抗原的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的cDNA，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID No.9，10和11的肽。
2.權(quán)利要求
1的cDNA，其中輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求
2的cDNA，包含SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
4.一種編碼抗乙型肝炎病毒的S-表面抗原的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)cDNA，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID No.12，13和14的肽。
5.權(quán)利要求
4的cDNA，其中重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求
5的cDNA，包含SEQ ID NO.6的核苷酸序列。
7.一種包含權(quán)利要求
1的cDNA的重組載體pCRA9Lv。
8.一種包含權(quán)利要求
4的cDNA的重組載體pCRA9Hv。
9.一種轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH5α/YRC-pCRA9Lv(KCTC 1011BP)，其轉(zhuǎn)化了重組載體pCRA9Lv。
10.一種轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH5α/YRC-pCRA9Hv(KCTC 1010BP)，其轉(zhuǎn)化了重組載體pCRA9Hv。
11.一種單克隆抗體的可變區(qū)，它由包括SEQ ID No.9，10和11的肽的輕鏈和包含SEQ ID No.12，13和14的肽的重鏈組成。
12.權(quán)利要求
11的單克隆抗體的可變區(qū)，其中輕鏈可變區(qū)具有SEQID NO.7的氨基酸序列，而重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種抗乙型肝炎病毒S－表面抗原的單克隆抗體的可變區(qū)及其編碼基因，一種包含上述基因的重組載體及一種從上述重組載體獲得的轉(zhuǎn)化體。
文檔編號(hào)C12N15/13GKCN1441844SQ01810440
公開(kāi)日2003年9月10日 申請(qǐng)日期2001年5月28日
發(fā)明者李鐘郁, 高仁泳, 康熙根, 南定鉉, 宋武泳, 文炯珍, 宋泰勛 申請(qǐng)人:株式會(huì)社柳韓洋行導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan