本發(fā)明屬于生物，涉及一種提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)類的數(shù)量和種類正在不斷的增加，并且已經(jīng)成為醫(yī)藥工業(yè)的重要部分。重組藥物蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核系統(tǒng)如e.coli，和真核系統(tǒng)如酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞293，cho細(xì)胞等。e?.coli適合表達(dá)分子量較小、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)，酵母表達(dá)系統(tǒng)適合表達(dá)分子量較大、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、較少糖基化的蛋白質(zhì)。而結(jié)構(gòu)或糖基化修飾對(duì)于人源性治療性蛋白的活性非常重要，因此，工業(yè)研發(fā)及生產(chǎn)多選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞293，cho細(xì)胞等。

2、重組蛋白的表達(dá)有瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)兩種，瞬時(shí)表達(dá)狀態(tài)下導(dǎo)入細(xì)胞的外源基因和宿主細(xì)胞染色體dna不發(fā)生整合，能夠短時(shí)間獲得目的蛋白，且其通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在早期研發(fā)階段，時(shí)間是個(gè)關(guān)鍵因素，雖然穩(wěn)轉(zhuǎn)獲得的蛋白表達(dá)量高，但是構(gòu)建周期長(zhǎng)，成本高，因此并不適合。?但是瞬轉(zhuǎn)表達(dá)中，由于細(xì)胞中的外源基因會(huì)隨著細(xì)胞分裂而丟失，目的蛋白表達(dá)只能維持幾天到十幾天時(shí)間，存在表達(dá)量低的缺點(diǎn)。那么如何提高瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)量，用最短的時(shí)間，最低的成本獲得更多的重組蛋白用于藥效，制劑研究，成為亟待解決的問(wèn)題。

3、目前，提高人源化細(xì)胞重組瞬時(shí)表達(dá)的方法主要分為兩種，一種是優(yōu)化細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境和轉(zhuǎn)染條件，包括1.選擇合適狀態(tài)的細(xì)胞，如密度，活率，代次等。2.合適的dna濃度以及轉(zhuǎn)染試劑濃度。3.調(diào)整培養(yǎng)基試劑配方等。但是以上常規(guī)方法存在有不穩(wěn)定性，重復(fù)性較低等缺陷。另一種方法是通過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)的方式提高目的蛋白表達(dá)，比如1.優(yōu)化宿主細(xì)胞系，減少細(xì)胞凋亡，以及細(xì)胞對(duì)外源蛋白的排異。2.優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)如在質(zhì)粒中設(shè)置附加體維持系統(tǒng)、?強(qiáng)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、蛋白質(zhì)反式激活系統(tǒng)，但是這些所有元素應(yīng)當(dāng)如何組合使用整合至表達(dá)載體中形成穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)仍然是目前尚需解決的技術(shù)問(wèn)題。

4、一個(gè)有效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體的組成元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、polya序列、選擇標(biāo)記、復(fù)制起始點(diǎn)、目的基因及增強(qiáng)子等。啟動(dòng)子是基因表達(dá)的重要調(diào)控元件，是一段能被rna聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合，能正確有效起始轉(zhuǎn)錄的段dna調(diào)控序列，一般位于目的基因5′端上游區(qū)域。生產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組蛋白常用的啟動(dòng)子這類載體用人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子(cmv)和猴空泡病毒早期啟動(dòng)子(sv40)等。其中cmv啟動(dòng)子常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建，但其易受表觀遺傳沉默的影響，導(dǎo)致表達(dá)水平隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸衰減。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、目前對(duì)啟動(dòng)子在不同遺傳背景下的可預(yù)測(cè)性和可組合性了解甚少。通常來(lái)說(shuō)，如果一個(gè)目的基因上游存在兩個(gè)同方向的啟動(dòng)子，一般是離表達(dá)基因atg近的那個(gè)啟動(dòng)子起作用。但是有時(shí)候兩個(gè)啟動(dòng)子有拮抗作用或協(xié)同作用時(shí)表達(dá)量會(huì)變化。已有研究表明，不同數(shù)量的啟動(dòng)子串聯(lián)導(dǎo)致活動(dòng)增加。但是到目前為止，還沒(méi)關(guān)于雙啟動(dòng)子cmv在不同組合下表達(dá)效果的研究，因此，這也是一個(gè)載體啟動(dòng)子改造的方向。本發(fā)明的目的在于對(duì)雙cmv啟動(dòng)子進(jìn)行改造，增強(qiáng)外源基因表達(dá)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)并公開了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一個(gè)方面公開了一種提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體，包含cmv-cmv雙啟動(dòng)子，所述cmv-cmv雙啟動(dòng)子由兩個(gè)序列相同的cmv啟動(dòng)子同向相連組成；

4、其中cmv-cmv雙啟動(dòng)子共同啟動(dòng)下游目的基因表達(dá)，cmv-cmv雙啟動(dòng)子之間的間隔為0-60bp。

5、優(yōu)選地，cmv-cmv雙啟動(dòng)子之間的間隔為優(yōu)選為0或40bp。

6、其中，所述重組表達(dá)載體含有以下元件：

7、復(fù)制起點(diǎn)、原核篩選標(biāo)記、真核篩選標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、用于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)、cmv-cmv雙啟動(dòng)子和來(lái)源于sv40的polya加尾信號(hào)。

8、所述用于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)包括pac?i、xba?i和not?i位點(diǎn)。

9、所述真核篩選標(biāo)記基因?yàn)楣劝滨０泛铣擅富颉?/p>

10、本發(fā)明第二個(gè)方面公開了上述提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體在制備重組質(zhì)粒中的應(yīng)用。重組質(zhì)粒中還包括目的基因。

11、本發(fā)明第三個(gè)方面公開了上述提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體、或上述的質(zhì)粒在制備重組細(xì)胞株中的應(yīng)用。

12、優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞株高表達(dá)目的基因的蛋白。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)勢(shì)：

14、本發(fā)明制備的含雙cmv啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體(啟動(dòng)子串聯(lián)共用表達(dá)框)，和原始載體相比（僅有一個(gè)cmv啟動(dòng)子），表達(dá)量提高量43%。

15、在啟動(dòng)子串聯(lián)共用表達(dá)框的情況下，啟動(dòng)子之間的間隔對(duì)表達(dá)量具有一定影響。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)不同間隔（雙cmv啟動(dòng)子之間）的表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)了在串聯(lián)啟動(dòng)子間隔0bp和40bp表達(dá)量出現(xiàn)峰值，啟動(dòng)效率最高。為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染馴化得到高表達(dá)目的蛋白的重組細(xì)胞提供了方向。

技術(shù)特征：

1.一種提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體，其特征在于，包含cmv-cmv雙啟動(dòng)子，所述cmv-cmv雙啟動(dòng)子由兩個(gè)序列相同的cmv啟動(dòng)子同向相連組成；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體含有以下元件：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述用于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)包括pac?i、xba?i和not?i位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述真核篩選標(biāo)記基因?yàn)楣劝滨０泛铣擅富颉?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體在制備重組質(zhì)粒中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，重組質(zhì)粒中還包括目的基因。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體在制備重組細(xì)胞株中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組細(xì)胞株高表達(dá)目的基因的蛋白。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高蛋白表達(dá)量的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。包含CMV?CMV雙啟動(dòng)子，所述CMV?CMV雙啟動(dòng)子由兩個(gè)序列相同的CMV啟動(dòng)子同向相連組成；其中CMV?CMV雙啟動(dòng)子共同啟動(dòng)下游目的基因表達(dá)，CMV?CMV雙啟動(dòng)子之間的間隔為0?60bp。本發(fā)明制備的含雙CMV啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體(啟動(dòng)子串聯(lián)共用表達(dá)框)，和原始載體相比（僅有一個(gè)CMV啟動(dòng)子），表達(dá)量提高量43%。在啟動(dòng)子串聯(lián)共用表達(dá)框的情況下，啟動(dòng)子之間的間隔對(duì)表達(dá)量具有一定影響。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)不同間隔（雙CMV啟動(dòng)子之間）的表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)了在串聯(lián)啟動(dòng)子間隔0bp和40bp表達(dá)量出現(xiàn)峰值，啟動(dòng)效率最高。為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染馴化得到高表達(dá)目的蛋白的重組細(xì)胞提供了方向。

技術(shù)研發(fā)人員：丁玥,朱雙光,黃一凡,婁文娟,肖志華
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海奧浦邁生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19