本發(fā)明屬于生物，涉及一種提高微球矩陣空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合了成像和測序技術(shù)，能夠繪制組織上特定轉(zhuǎn)錄物存在的位置，從而指示特定基因的特定位點(diǎn)表達(dá)?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的出現(xiàn)，為人類提供了一種更高維度解析生命本質(zhì)的強(qiáng)大工具?？臻g轉(zhuǎn)錄組在發(fā)育生物學(xué)、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)科學(xué)等方面提供了新的見解。

2、空間轉(zhuǎn)錄組目前主要面臨的問題有兩點(diǎn)，一是如何提高捕獲的分辨率，從而滿足單細(xì)胞級別的空間轉(zhuǎn)錄組分析，在固相捕獲芯片上，需要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄本的捕獲數(shù)量，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的單細(xì)胞分割分析；另一方面，如何有效使用大尺寸的捕獲芯片，以滿足大組織的全景視圖的分析。

3、主流平臺10×genomics平臺在2019年推出商業(yè)化visium空間轉(zhuǎn)錄組芯片，捕獲面積6.5?mm×6.5?mm，這種尺寸的捕獲面積只能局限于毫米級別的小組織分析。2023年推出的visium?cytassist平臺最大僅支持11?mm×11?mm的捕獲區(qū)域。而且cytassist樣本是基于探針捕獲的原理獲得細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)信息，與常規(guī)單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組通過3’-polya捕獲mrna不同，不利于后期的聯(lián)合分析。另一主流平臺為bgi的stereo-seq平臺，提供從5mm×5?mm-130?mm×130?mm的厘米級大視場切片空間轉(zhuǎn)錄組捕獲芯片，但是硅基芯片無法進(jìn)行高清的he圖像掃描，且基于測序芯片制作的空轉(zhuǎn)芯片，價格極其昂貴。

4、hdst（high-definition?spatial?transcriptomics）是一種高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，它通過在組織切片上使用密集的微球矩陣來捕獲rna，從而實(shí)現(xiàn)在組織原位進(jìn)行高分辨率的基因表達(dá)分析。hdst使用三段式微球進(jìn)行合成，大概有2,893,865個不同的微球，這使得微球庫只適用于小面積的捕獲分析，當(dāng)捕獲面積增大時，微球的重復(fù)性增多，無法保證條形碼（barcode）的拆分導(dǎo)致數(shù)據(jù)的浪費(fèi)，分辨率降低。且此方法使用65×211×211的微球合成方式，解碼使用14輪解碼，若提高微球庫數(shù)量，則芯片解碼輪次提高，且需要合成更多的解碼探針以組合解碼探針池。s1000?芯片為6.8?mm×6.8?mm的矩陣，包含約220萬個微坑，當(dāng)使用384×384×384的微球池時，微球總種類56623104，重復(fù)率大概4%；微坑提升至410萬，則重復(fù)率提升至7%；微坑提升至1000萬時，重復(fù)率大概17%。如果提升微球池的種類，768×768×768的微球池，220萬的微坑數(shù)，重復(fù)率大概0.5%；微坑提升至410萬，重復(fù)率1%；微坑提升至1000萬，重復(fù)率2%，但是微球引物合成成本需要提升一倍，解碼探針合成以及解碼輪次也要有一定程度的提升，這無疑限制了產(chǎn)品的更新。使用384×384×384的微球池，如果將捕獲面積提升至13.6?mm×13.6?mm，微坑為1640萬時，重復(fù)率在25%左右。捕獲面積進(jìn)一步提升，微坑數(shù)將超過微球的種類數(shù)，則需要更大的微球池來進(jìn)行芯片組裝，同時，微球的解碼探針及解碼流程也要進(jìn)行相應(yīng)的更新，這種提高的成本極大。

5、綜上所述，如何提高微球矩陣芯片空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積仍是空間轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域亟需解決的問題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實(shí)際需求，本發(fā)明提供一種提高微球矩陣空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積的方法及其應(yīng)用，以期實(shí)現(xiàn)使用大尺寸微球矩陣捕獲芯片進(jìn)行捕獲及文庫構(gòu)建。

2、為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種提高微球矩陣空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積的方法，所述方法包括：

4、進(jìn)行組織透化處理，使用微球矩陣捕獲芯片進(jìn)行捕獲，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和cdna一鏈合成、cdna二鏈合成，將微球矩陣捕獲芯片進(jìn)行分區(qū)，對每個區(qū)域解鏈以及cdna擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；所述分區(qū)的方法包括芯片破碎分區(qū)法或雜交墊片分區(qū)法；所述芯片破碎分區(qū)法包括將微球矩陣捕獲芯片破碎為多個分區(qū)；所述雜交墊片分區(qū)法包括使用雜交墊片對微球矩陣捕獲芯片進(jìn)行分區(qū)。

5、針對目前使用大尺寸微球矩陣捕獲芯片中，需要使用大量條形碼（barcode）、微球池，以及操作繁瑣、成本高等問題，本發(fā)明設(shè)計采用全新思路，使用大尺寸微球矩陣捕獲芯片對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行捕獲后，先統(tǒng)一操作生產(chǎn)二鏈cdna，然后對芯片基底進(jìn)行破碎分區(qū)或者采用雜交墊片分區(qū)的方式，將生成的二鏈分區(qū)域解鏈下來，后期測序完成后，可按照分區(qū)的方式對測序結(jié)果進(jìn)行回溯整合，最后生成一張大視場的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。與傳統(tǒng)的方法相比，并不需要提高條形碼（barcode）的種類，減少了擴(kuò)大微球池時，合成微球引物的數(shù)量以及解碼探針的種類，有效節(jié)省成本，另外也無需更多的解碼輪次即可實(shí)現(xiàn)微球芯片的解碼，能減少解碼過程對捕獲芯片的損傷，有效提高了大尺寸微球矩陣捕獲芯片的捕獲效率。

6、本發(fā)明所述微球矩陣捕獲芯片指用于空間轉(zhuǎn)錄組捕獲或者空間多組學(xué)分析的芯片，可以理解，本領(lǐng)域中功能類似的捕獲芯片均適用于本發(fā)明，如hdst技術(shù)中使用三段式微球進(jìn)行合成獲得的具有微球矩陣的捕獲芯片等。

7、本發(fā)明中，所述雜交墊片指附帶粘合劑的硅膠墊片，可在幾秒內(nèi)與捕獲芯片結(jié)合，然后形成不同的分割區(qū)域。

8、優(yōu)選地，所述分區(qū)設(shè)置的區(qū)域個數(shù)為2~225個，例如可以2、3、4、5、6、10或20個等等，不再一一列舉。

9、優(yōu)選地，所述微球矩陣捕獲芯片的面積為0.25?cm2~225?cm2。

10、本發(fā)明中，分區(qū)的形狀可以設(shè)計為網(wǎng)格狀，如日字格，田字格等，不同分區(qū)間的面積可以為0.125?cm2~10?cm2。

11、優(yōu)選地，所述組織透化處理的組織透化液含有胃蛋白酶、tritonx-100或hcl中至少一種；所述組織透化液中胃蛋白酶質(zhì)量百分比為0.01%~1%（例如可以是0.02%、0.03%、0.05%、0.1%、0.12%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%或0.9%等）；所述組織透化液中tritonx-100的濃度為0.1~2?mm（例如可以是0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8或1.9?mm等）；所述組織透化液中hcl的濃度為0.1~1?m（例如可以是0.2、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9?m等）。

12、優(yōu)選地，所述反轉(zhuǎn)錄和cdna一鏈合成的試劑包括反轉(zhuǎn)錄緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、dntps、dtt和鏈置換引物；其中，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液含有100~500?mm?tris-hcl、200~500?mm?kcl、10~30?mm?mgcl2和10~100?mm?dtt。

13、上述數(shù)值范圍表示可在所列范圍內(nèi)任選，如100~500?mm可以選擇101、102、110、120、150、200、220、240、260、300、320、350、380、400、450、460、470、480或490?mm等等，200~500?mm可以是201、202、205、210、220、240、280、300、320、350、380、400、450、460、470、480或490?mm等等，10~30?mm可以為11、12、13、14、15、20、22、26、28或29?mm等等，10~100?mm可以是11、12、15、18、20、25、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、92、94、96或98?mm等等。

14、本發(fā)明中，可以使用市面上常見的反轉(zhuǎn)錄酶，如thermofisher公司的superscript??ii、superscript??iii、superscript??iv；vazyme公司的hiscript?ii?reversetranscriptase、hiscript?iii?reverse?transcriptase、hiscript?reversetranscriptase等反轉(zhuǎn)錄酶的一種或多種。

15、dntps：1~20?mm?dntps；dtt：1~200?mm?dtt；ssp：10~100μm鏈置換引物。

16、優(yōu)選地，所述cdna二鏈合成的試劑包括二鏈合成緩沖液、dntps、dna聚合酶和二鏈反應(yīng)引物；其中，二鏈合成緩沖液含有100~300?mm?tris-hcl，50~200?mm?(nh4)2so4，100~1000?mm?kcl，10~50?mm?mgso4和0.5%~5%?tween-20，ph為7~9。

17、上述數(shù)值范圍表示可在所列范圍內(nèi)任選，如100~300?mm可以選擇101、102、110、120、150、200、220、240、260、270、280或290?mm等等，50~200?mm可以是51、52、55、60、80、90、100、120、150、180或190?mm等等，100~1000?mm可以為101、102、103、140、180、200、220、280、300、350、380、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、920、940、960、970、980或990?mm等等，10~50?mm可以是11、12、15、18、20、25、28、30、35、40、45、46或48?mm等等，0.5%~5%可以是0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%或4.9%。

18、dntps：1~20?mm?dntps；second?strand?enzyme：dna聚合酶i大片段（klenow）、dna聚合酶i（e.?coli）等具有dna合成功能的聚合酶中的一種或多種；二鏈反應(yīng)引物（secondstrand?primer）：1-100?μm二鏈反應(yīng)引物。

19、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的提高微球矩陣空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積的方法在構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序文庫中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明提供大視場空間轉(zhuǎn)錄組芯片的操作方法，通過物理破碎或者雜交墊片分區(qū)的方式進(jìn)行二鏈產(chǎn)物的分區(qū)回收。

21、第三方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序文庫的方法，所述方法使用第一方面所述的提高微球矩陣空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積的方法進(jìn)行捕獲，具體包括以下步驟：（1）組織貼片、固定及染色處理；（2）組織透化處理；（3）反轉(zhuǎn)錄和cdna一鏈合成；（4）cdna二鏈合成；（5）cdna分區(qū)解鏈及pcr擴(kuò)增；（6）cdna純化。

22、優(yōu)選地，步驟（1）包括：將組織切片貼在微球矩陣捕獲芯片上進(jìn)行固定及染色處理，其中所述微球矩陣捕獲芯片帶有mrna捕獲探針。

23、優(yōu)選地，步驟（2）包括：將步驟（1）所得微球矩陣捕獲芯片放入所述組織透化液中于30~40℃孵育2~30?min，去除組織透化液并向微球矩陣捕獲芯片的孔內(nèi)加入ssc溶液（saline?sodium?citrate，濃度為0.1×~5×）。

24、優(yōu)選地，步驟（3）包括：去除微球矩陣捕獲芯片孔內(nèi)的ssc溶液，將所述反轉(zhuǎn)錄和cdna一鏈合成的試劑加入孔內(nèi)，于37~65℃（例如可以是38、39、40、41、42、43、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64℃等）孵育0.5~2?h（優(yōu)選42℃孵育1.5?h）。

25、優(yōu)選地，步驟（4）包括：去除微球矩陣捕獲芯片孔內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄和cdna一鏈合成的試劑，加入koh（濃度為0.05~0.5m）溶液進(jìn)行解鏈變性后，用eb緩沖液進(jìn)行洗滌，然后加入所述cdna二鏈合成的試劑，于45~70℃（例如可以是46、47、48、49、50、55、60、61、62、65、66、67、68或69℃等）孵育10~40?min（優(yōu)選65℃孵育30分鐘）。

26、優(yōu)選地，所述eb緩沖液為10?mm?tris-hcl，ph?7.5。

27、優(yōu)選地，步驟（5）包括：去除微球矩陣捕獲芯片孔內(nèi)的cdna二鏈合成的試劑，加入eb緩沖液進(jìn)行洗滌，將微球矩陣捕獲芯片分區(qū)后再加入koh，于20~30℃孵育2~10?min，然后用0.1~1?m?tris(ph=6~8)中和koh后，對每個區(qū)域分別加入cdna擴(kuò)增試劑進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

28、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增程序為：95-98℃、20~40?s；95~98℃、15~30s，62~68℃、15~30s，60~70℃、4~8?min，10~20個循環(huán)；60~70℃、4~6?min。

29、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增程序為：95℃、30?s；95℃、15s，62℃、15?s，65℃、8min，15個循環(huán)；65℃、6?min。

30、優(yōu)選地，步驟（6）包括：將步驟（5）擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠進(jìn)行純化，然后用乙醇洗滌磁珠，最后用eb緩沖液將擴(kuò)增產(chǎn)物從磁珠上洗脫下來。

31、優(yōu)選地，所述構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序文庫的方法還包括cdna質(zhì)控的步驟。

32、優(yōu)選地，所述cdna質(zhì)控包括測定純化后cdna產(chǎn)物濃度以及對cdna產(chǎn)物峰型進(jìn)行測定。

33、第四方面，本發(fā)明提供一種空間轉(zhuǎn)錄組測序方法，所述空間轉(zhuǎn)錄組測序方法利用第三方面所述的構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序文庫的方法構(gòu)建文庫，對每個分區(qū)進(jìn)行測序，按照分區(qū)的方式對測序結(jié)果進(jìn)行回溯整合，得到空間轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。

34、優(yōu)選地，所述空間轉(zhuǎn)錄組測序方法具體包括：（1）利用第三方面所述的構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序文庫的方法構(gòu)建文庫；（2）對每個分區(qū)進(jìn)行測序，對每個分區(qū)的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行barcode、umi（唯一分子標(biāo)記）識別，比對基因組及barcode位置確定；（3）將不同分區(qū)的barcode對應(yīng)的表達(dá)信息進(jìn)行合并；（4）將不同分區(qū)的barcode位置信息進(jìn)行合并，對分區(qū)邊緣臨近部分的點(diǎn)位（spot），根據(jù)不同分區(qū)識別到的barcode和umi結(jié)果確定目標(biāo)barcode信息；（5）對于不同分區(qū)中出現(xiàn)重復(fù)的barcode進(jìn)行過濾；（6）得到上述結(jié)果后生成空間的表達(dá)矩陣文件，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到完整的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

35、本發(fā)明中，開發(fā)便捷、高效使用大面積捕獲芯片的空間轉(zhuǎn)錄組測序方法，可有效針對大面積組織進(jìn)行分析，可有效應(yīng)用于疾病診斷或非疾病診斷領(lǐng)域（如基因表達(dá)機(jī)制的基礎(chǔ)研究）等。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

37、本發(fā)明設(shè)計提高微球矩陣空間轉(zhuǎn)錄組捕獲面積的方法，采用全新思路，將芯片進(jìn)行破碎分區(qū)或者使用雜交墊片設(shè)置分區(qū)進(jìn)行檢測，操作簡單易行，與傳統(tǒng)的方法相比，在使用大面積捕獲芯片的同時，并不需要直接提高條形碼（barcode）的種類，減少了擴(kuò)大微球池時，合成微球引物的數(shù)量以及解碼探針的種類，有效節(jié)省成本，另外也無需更多的解碼輪次即可實(shí)現(xiàn)微球芯片的解碼，能減少解碼過程對捕獲芯片的損傷，有效提高了大尺寸空間轉(zhuǎn)錄組芯片捕獲的效率。