本發(fā)明屬于廢水處理，具體涉及一種降解尼古丁廢水的工程希瓦氏菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、中國是世界最大的煙草生產(chǎn)國，在煙草加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量固體和液體廢棄物，其中，尼古丁是煙草葉片中的主要生物堿，會(huì)隨著廢棄物滲入環(huán)境。尼古丁由于其特殊的結(jié)構(gòu)，具有高度成癮性、很高的毒性和致癌性，長期攝入尼古丁會(huì)增加癌癥的發(fā)生率。因此，從水體中有效去除尼古丁對于保障公眾健康和保護(hù)環(huán)境具有重要意義。

2、生物降解處理因其綠色溫和和高效簡單被認(rèn)為是較為有效的尼古丁降解方式。然而，尼古丁具有顯著的生物毒性，使得大多數(shù)微生物都不具備尼古丁的降解能力，給微生物處理體系帶來了諸多挑戰(zhàn)。為應(yīng)對尼古丁這些難降解有毒污染物，需采用先進(jìn)的生物強(qiáng)化技術(shù)，通過基因工程改造獲得高效降解尼古丁的菌株，提升處理系統(tǒng)的效率和穩(wěn)定性。

3、希瓦氏菌是一種廣泛分布在湖泊沉積物和海洋沉積物等水生環(huán)境中的電活性細(xì)菌，作為一種電活性微生物，該類菌株通過胞外電子傳遞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移用于有毒有害難降解污染物的還原，具有較強(qiáng)的環(huán)境耐受性，適應(yīng)于包含多種復(fù)雜的有毒難降解污染物的廢水的生物降解，但是目前還沒有研究表明該菌株具有氧化有毒污染物的能力。

4、通過生物信息學(xué)分析得出假單胞菌中具有黃素酶nica2，該酶可以氧化尼古丁并且將氧化的電子傳遞給細(xì)胞色素c蛋白。設(shè)計(jì)對希瓦氏菌代謝路徑進(jìn)行調(diào)控，賦予希瓦氏菌氧化尼古丁的能力，不僅可以實(shí)現(xiàn)尼古丁有毒污染物的降解，還可以耦合電子傳遞體系實(shí)現(xiàn)產(chǎn)電，在污染物的生物脫毒領(lǐng)域具有重要價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種降解尼古丁廢水的工程希瓦氏菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)廢水中的尼古丁的高效降解。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供一種降解尼古丁廢水的工程希瓦氏菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

4、步驟一、分別以黃素酶nica2基因片段為模板，f-1和r-1作為引物、阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因片段為模板，f-2和r-2作為引物、載體質(zhì)粒pyydt基因片段為模板，f-3和r-3作為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得3個(gè)目的基因片段；

5、步驟二、將3個(gè)目的基因片段通過gibson連接到載體質(zhì)粒pyydt上，獲得pyydt-nica2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，以ck-f-1和ck-r-1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證，培養(yǎng)陽性克隆菌株，提取pyydt-nica2質(zhì)粒；

6、步驟三、分別以細(xì)胞色素c蛋白基因片段為模板，f-4和r-4作為引物；以pyydt-nica2質(zhì)粒為模板，f-5和r-5作為引物，使用pcr擴(kuò)增獲得2個(gè)基因片段；

7、步驟四、將步驟三的2個(gè)目的基因片段通過gibson連接獲得pyydt-nc質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，以ck-f-1和ck-r-1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證，培養(yǎng)陽性克隆菌株，提取陽性pyydt-nc質(zhì)粒；

8、步驟五、將陽性pyydt-nica2質(zhì)粒和pyydt-nc質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入希瓦氏菌感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建工程希瓦氏菌mr-1/pyydt-nc和工程希瓦氏菌mr-1/pyydt-nica2，進(jìn)行基因表達(dá)驗(yàn)證。

9、進(jìn)一步地，所述黃素酶nica2基因片段的序列如seq?id?no.1所示，阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因片段的序列如seq?id?no.2所示，載體質(zhì)粒pyydt基因片段的序列如seq?idno.3所示，細(xì)胞色素c蛋白基因片段的序列如seq?id?no.4所示。

10、進(jìn)一步地，所述f-1的序列如seq?id?no.5所示；所述r-1的序列如seq?id?no.6所示；所述f-2的序列如seq?id?no.7所示；所述r-2的序列如seq?id?no.8所示；所述ck-f-1的序列如seq?id?no.9所示；所述ck-r-1的序列如seq?id?no.10所示；所述f-3的序列如seqid?no.11所示；所述r-3的序列如seq?id?no.12所示；所述f-4的序列如seq?id?no.13所示；所述r-4的序列如seq?id?no.14所示；所述f-5的序列如seq?id?no.15所示；所述r-5的序列如seq?id?no.16所示。

11、進(jìn)一步地，步驟二和步驟四中，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆的具體步驟如下：將gibson連接獲得的pyydt-nica2質(zhì)粒和pyydt-nc質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入turbo大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用pcr擴(kuò)增驗(yàn)證陽性后提取質(zhì)粒，獲得pyydt-nica2質(zhì)粒和pyydt-nc質(zhì)粒。

12、進(jìn)一步地，所述電轉(zhuǎn)入的步驟如下：

13、將陽性pyydt-nica2質(zhì)粒和pyydt-nc質(zhì)粒各1μg分別與100μl希瓦氏菌感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)移到1mm無菌電穿孔比色皿中，2.5kv電轉(zhuǎn)5ms后立即將混合物加入1ml?lb液體培養(yǎng)基中，30°c下孵育1h，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的lb瓊脂平板，30℃培育1天后，挑取單克隆進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證，獲得陽性克隆工程希瓦氏菌株mr-1/pyydt-nica2和mr-1/pyydt-nc。

14、進(jìn)一步地，所述希瓦氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備如下：

15、將4ml活化后的希瓦氏菌在50ml?lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，離心后收集菌株，利用4℃的300mm蔗糖溶液清洗兩次，再加入100?μl的300mm蔗糖溶液重懸，獲得希瓦氏菌感受態(tài)細(xì)胞。

16、進(jìn)一步地，希瓦氏菌的活化步驟如下：

17、將希瓦氏菌菌株從-80℃冰箱中取出，取40μl菌液放入4ml?lb培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12h獲得活化后的希瓦氏菌菌株。

18、進(jìn)一步地，所述振蕩培養(yǎng)的溫度設(shè)置為：大腸桿菌37℃，希瓦氏菌30℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為200?rpm，lb培養(yǎng)基配方為：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l?nacl。

19、進(jìn)一步地，所述基因表達(dá)驗(yàn)證是將工程希瓦氏菌mr-1/pyydt-nica2和工程希瓦氏菌mr-1/pyydt-nc進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分子驗(yàn)證，將菌株在30℃下置于含有10μm阿拉伯糖溶液的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)后的細(xì)胞提取總rna，進(jìn)行rt-qpcr反應(yīng)。

20、更進(jìn)一步地，所述提取總rna中使用rna提取試劑盒；所述rna提取試劑盒為takara公司的rnaiso?plus?kit提取試劑。

21、更進(jìn)一步地，所述rt-qpcr反應(yīng)為使用一鏈cdna合成試劑和探針法qpcr試劑利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr系統(tǒng)進(jìn)行rt-qpcr反應(yīng)；

22、所述一鏈cdna合成試劑為takara公司的primescript?ii?first?strand?cdnasynthesis?kit試劑，探針法qpcr試劑為takara公司的sybr?premix?ex?taq試劑。

23、本發(fā)明還提供一種降解尼古丁廢水的工程希瓦氏菌的應(yīng)用，利用上述構(gòu)建方法得到的工程希瓦氏菌降解煙草廢水中的尼古丁。

24、本發(fā)明的有益效果：

25、基因合成黃素酶nica2、細(xì)胞色素c蛋白（ cycn）基因和阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因，將其與載體質(zhì)粒pyydt連接，構(gòu)建質(zhì)粒pyydt-nc，通過電轉(zhuǎn)入希瓦氏菌感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建工程希瓦氏菌mr-1/pyydt-nc。該工程菌株在尼古丁氧化和實(shí)際尼古丁廢水處理中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，能夠高效氧化降解尼古丁，且本發(fā)明證實(shí)了細(xì)胞色素c蛋白cycn是nica2的高效專項(xiàng)電子受體，可加速尼古丁氧化降解。