本發(fā)明屬于活性物質提取，具體涉及一種底鍋水多糖及其聯(lián)合氯化膽堿-果糖深共熔溶劑提取方法和應用。

背景技術：

1、白酒是以高粱、大米、小麥、豌豆和玉米等為原料，在發(fā)酵劑作用下，經(jīng)原料粉碎、發(fā)酵、蒸餾、貯存及勾調等工藝而制成的蒸餾酒。在我國歷史悠久，規(guī)模較大。近年來，隨著白酒行業(yè)的迅速發(fā)展，其釀酒副產(chǎn)物(酒糟、廢水等)也在大量產(chǎn)出。釀酒廢水是白酒生產(chǎn)過程中主要的副產(chǎn)物資源，據(jù)不完全統(tǒng)計，每生產(chǎn)1t白酒會產(chǎn)出約48t的廢水。其中底鍋水是釀酒廢水的主要來源之一，是糧食糊化和糟醅蒸餾時水蒸氣在糟醅中反復冷凝、下沉聚集在鍋底中與原有水分混合形成的液體。此外，在實際生產(chǎn)過程中，也會將黃水加入底鍋中一起蒸餾以提高酒的產(chǎn)量，這時底鍋水通常為黃褐色或者褐色。底鍋水組成成分復雜多樣，含有淀粉、還原糖、醇類、有機酸等有機物質，若直接處理不僅難度大、成本高，也會導致其中有機組分未被充分利用而造成資源浪費，因此對底鍋水的資源化利用具有重要意義。

2、隨著健康飲食觀的興起，提取天然活性成分用于功能性食品、藥品等受到廣泛關注，多糖是一類由許多相同或不同的單糖以α/β-糖苷鍵連接而成的天然大分子多聚物，具有抗氧化、抗炎和降血糖等多種活性，在臨床治療和預防疾病方面應用較多。

3、現(xiàn)有技術中關于白酒釀造底鍋水資源化利用方面較少，如發(fā)明cn115160030a中利用底鍋水生產(chǎn)含γ-聚谷氨基酸液態(tài)有機肥；發(fā)明cn114315046a以釀酒廢水為原料制備生物活性發(fā)酵濾液，從而有效利用其中有效組分；發(fā)明cn116769840a公開了利用釀酒底鍋水生產(chǎn)小球藻生長因子的方法。而關于底鍋水活性成分制備方面，僅發(fā)明cn1176999876a公開了一種釀酒底鍋水資源化利用的方法，其中建立了粗多糖提取方法。雖然該方法上在一定程度上回收了底鍋水中多糖有益成分，但依然存在如下問題：(1)提取過程繁瑣，工業(yè)化應用生產(chǎn)難度大、成本高；(2)提取過程需進行濃縮，若不能較好的控制濃縮溫度，難以確保多糖結構和活性不受破壞；(3)該技術僅局限于底鍋水多糖粗提物制備方法，其分離鑒定方面尚無研究。

4、因此，運用綠色高效的深共熔溶劑對底鍋水多糖進行分離純化，分析其結構特征，探究其功能活性，為其在食品、保健藥品及化妝品方面的應用提供理論基礎，具有重要現(xiàn)實意義。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種聯(lián)合天然深共熔溶劑(nades)提取分離底鍋水多糖的方法。該方法利用nades提取、醇沉、透析、離子交換柱和葡聚糖凝膠柱層析等方法，對底鍋水多糖進行分離純化，并采用掃描電鏡、紅外和核磁等技術鑒定多糖結構，同時探究其體外抗氧化活性。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種底鍋水多糖的聯(lián)合氯化膽堿-果糖深共熔溶劑提取方法，其包括以下步驟：

3、a、將釀酒底鍋水靜置離心后，將離心后的底鍋水與深共熔溶劑混合，在超聲條件下，進行液液萃取，得到提取液；步驟a中，所述深共熔溶劑由以下方法制備得到：按照摩爾比為1：1～4，取氯化膽堿和果糖混合均勻后，加入氯化膽堿和果糖總質量10～40％的水，加熱攪拌(促使各組分之間氫鍵的形成)直至形成均一穩(wěn)定澄清透明的液體，即得氯化膽堿-果糖nades；

4、b、將步驟a所得提取液經(jīng)冷卻、醇沉、固液分離和凍干后，得到底鍋水粗多糖；

5、c、將步驟b所得底鍋水粗多糖配制為水溶液后，加入sevage試劑去除蛋白質，收集上層糖液，然后經(jīng)透析去除可溶性小分子物質，透析所得溶液經(jīng)凍干，得底鍋水多糖dgsp。

6、其中，上述提取方法，步驟a中，所述釀酒底鍋水靜置過濾的具體操作為：釀酒底鍋水0～4℃靜置24～48h后，至少進行一次離心處理，首次離心條件：溫度0～4℃，轉速8000～10000rpm，時間15～20min；后續(xù)離心條件：溫度0～4℃，轉速5000～8000rpm，時間10～15min。

7、其中，上述提取方法，步驟a中，所述離心后的底鍋水與深共熔溶劑的體積比為1：1～2。

8、其中，上述提取方法，步驟a中，所述超聲的功率為200～400w。

9、其中，上述提取方法，步驟a中，所述液液萃取的溫度為40～60℃。

10、其中，上述提取方法，步驟a中，所述液液萃取的時間為40～60min。

11、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟a中，制備深共熔溶劑時，氯化膽堿和果糖的摩爾比為1：1～2。

12、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟a中，制備深共熔溶劑時，加入氯化膽堿和果糖總質量10～20％的水。

13、其中，上述提取方法，步驟a中，制備深共熔溶劑時，所述加熱攪拌的溫度為80～90℃。

14、其中，上述提取方法，步驟a中，制備深共熔溶劑時，所述加熱攪拌的時間為5～6h。

15、其中，上述提取方法，步驟b中，所述醇沉為：將提取液和無水乙醇按照體積比1：3～5混合，在0～4℃下靜置沉淀24～48h。

16、其中，上述提取方法，步驟b中，所述固液分離采用離心。

17、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟b中，固液分離時，所述離心為：在溫度0～4℃和轉速8000～10000rpm的條件下，離心15～20min，收集沉淀。

18、其中，上述提取方法，步驟b中，所述凍干的條件為：溫度-80～-60℃，真空度1～2pa，時間24～48h。

19、其中，上述提取方法，步驟c中，將底鍋水粗多糖配置成濃度10～20mg/ml的水溶液。

20、其中，上述提取方法，步驟c中，底鍋水粗多糖水溶液和sevage試劑的體積比為4～5：1。

21、其中，上述提取方法，步驟c中，所述收集上層糖液采用離心。

22、優(yōu)選的，上述提取方法，收集上層糖液時，所述離心為：在溫度0～4℃和轉速5000～8000rpm的條件下離心10～15min，收集上層糖液。

23、其中，上述提取方法，步驟c中，所述透析為：利用透析袋在0～4℃下透析36～48h以截留分子量大于3500da的組分，期間每隔6～8h更換一次水。

24、其中，上述提取方法，步驟c中，所述凍干的條件為：溫度-80～-60℃，真空度1～2pa，時間24～48h。

25、本發(fā)明還提供了一種底鍋水多糖的聯(lián)合氯化膽堿-果糖深共熔溶劑提取方法，其在上述方法的基礎上，還包括以下步驟：

26、d、將步驟c所得底鍋水多糖dgsp配制成水溶液后，先采用陰離子交換柱層析純化，得到底鍋水多糖dgspx，再采用葡聚糖凝膠柱層析純化，得到底鍋水多糖dgspb-1。

27、其中，上述提取方法，步驟d中，將步驟c所得底鍋水多糖dgsp配置成濃度10～20mg/ml的水溶液。

28、其中，上述提取方法，步驟d中，所述陰離子交換柱層析純化的操作為：將底鍋水多糖dgsp水溶液上樣至deae52陰離子交換纖維素柱，洗脫液依次為0～0.4mol/l?nacl溶液，期間用苯酚-硫酸法測定多糖含量，接至無多糖液體流出，分別收集0mol/l、0.1mol/l和0.4mol/l時的有效多糖組分，經(jīng)透析和凍干，得到底鍋水多糖dgspx，所述底鍋水多糖dgsp包括dgspa、dgspb和/或dgspc，其中，0mol/l時的有效多糖組分對應得到dgspa，0.1mol/l時的有效多糖組分對應得到dgspb，0.4mol/l時的有效多糖組分對應得到dgspc。

29、步驟d中，陰離子交換柱層析純化時，dgspb為主要洗脫峰，其余兩個吸光度值較低。因此優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，所述陰離子交換柱層析純化的操作為：將底鍋水多糖dgsp水溶液上樣至deae52陰離子交換纖維素柱，洗脫液依次為0～0.1mol/l?nacl溶液，期間用苯酚-硫酸法測定多糖含量，接至無多糖液體流出，收集0.1mol/l時的有效多糖組分，經(jīng)透析和凍干，得到dgspb。

30、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，陰離子交換柱層析純化時，洗脫液流速為1～2ml/min，每4～5ml收集一管。

31、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，陰離子交換柱層析純化時，所述透析為：利用透析袋在0～4℃下透析36～48h以截留分子量大于3500da的組分，期間每隔6～8h更換一次水。

32、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，陰離子交換柱層析純化時，所述凍干的條件為：溫度-80～-60℃，真空度1～2pa，時間24～48h。

33、其中，上述提取方法，步驟d中，將陰離子交換柱層析純化所得dgspb配置成濃度10～20mg/ml的水溶液。

34、其中，上述提取方法，步驟d中，所述葡聚糖凝膠柱層析純化的操作為：將陰離子交換柱層析純化所得dgspb配置成水溶液，上樣至sephadex?g-100葡聚糖凝膠柱層析，洗脫液為水，期間用苯酚-硫酸法測定多糖含量，接至無多糖液體流出，收集有效多糖組分，經(jīng)透析和凍干，得到底鍋水多糖dgspb-1。

35、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，葡聚糖凝膠柱層析純化時，洗脫液流速為1～2ml/min，每4～5ml收集一管。

36、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，葡聚糖凝膠柱層析純化時，所述透析為：利用透析袋在0～4℃下透析36～48h以截留分子量大于3500da的組分，期間每隔6～8h更換一次水。

37、優(yōu)選的，上述提取方法，步驟d中，葡聚糖凝膠柱層析純化時，所述凍干的條件為：溫度-80～-60℃，真空度1～2pa，時間24～48h。

38、本發(fā)明通過凝膠滲透色譜儀(gpc)測定純化后多糖組分分子量；掃描電鏡、紅外光譜和核磁共振分析多糖理化性質。其中，上述提取方法，步驟d中，所述底鍋水多糖dgspb-1的分子量為11.8832kda，其單糖組成的摩爾比為glc：rib：rha：man：glca：gal：xyl：ara＝26.97：3.03：0.68：52.44：5.31：3.44：2.68：5.45。

39、本發(fā)明還提供了底鍋水多糖dgsp、底鍋水多糖dgspx和/或底鍋水多糖dgspb-1，其采用上述方法提取所得。

40、本發(fā)明以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基和羥基(oh)自由基和總抗氧化能力為指標評價底鍋水多糖抗氧化活性。經(jīng)試驗，本發(fā)明底鍋水多糖dgsp、底鍋水多糖dgspx和/或底鍋水多糖dgspb-1具有優(yōu)異的自由基清除能力，因此本發(fā)明還提供了上述底鍋水多糖dgsp、底鍋水多糖dgspx和/或底鍋水多糖dgspb-1在制備自由基清除劑中的應用。

41、優(yōu)選的，上述用途中，所述自由基為dpph自由基和/或oh自由基。

42、本發(fā)明中，白酒釀造廢水底鍋水為本領域公知物質，其可參考文獻1(羅玉婷，張煜亮，稅梁揚等.四尾柵藻處理白酒釀造廢水底鍋水的研究[j].現(xiàn)代化工，2024，44(02)：206-210)、文獻2(姜翰達，嚴鹿鳴，李蓉等.白酒釀造底鍋水資源化生產(chǎn)小球藻生長因子[j].化學與生物工程，2024，41(07)：37-43)等文獻。

43、本發(fā)明的有益效果：

44、本發(fā)明制備的氯化膽堿-果糖nades溶劑綠色高效，可作為底鍋水多糖物質的良好提取劑?？紤]到底鍋水組成復雜，在進行提取前首先對底鍋水進行了預處理，低溫靜置、離心等方式最大限度的將底鍋水中不溶性雜質去除，該法溫和，不破壞底鍋水中有效成分的化學結構；提取過程中底鍋水與氯化膽堿-果糖nades溶劑按不同體積比進行添加以調節(jié)提取液的極性，以確保底鍋水中不同極性的多糖分子溶出，提高提取含量和效率。

45、sevage試劑中以無毒的二氯甲烷替代危險化學品三氯甲烷，確保提取過程無危險化學品的使用，同時又能有效去除粗多糖中的蛋白質、色素等雜質，便于后續(xù)分析。利用deae52陰離子交換纖維素柱和sephadex?g-100葡聚糖凝膠柱層析純化底鍋水粗多糖，并對純化后的底鍋水多糖進行結構判定。本發(fā)明不僅從底鍋水中有效提取多糖物質，還進一步分離出底鍋水多糖，并解析其分子量、單糖組成、結構和抗氧化能力等，說明該分離鑒定方法有效可行，分析結構準確可靠，彌補了現(xiàn)有底鍋水多糖分離鑒定的空白，解決現(xiàn)有技術中分離鑒定底鍋水多糖的難題。