本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自然過程和人類活動(dòng)均會(huì)導(dǎo)致有毒重金屬在環(huán)境和食物鏈中積累。即使?jié)舛群艿偷闹亟饘僖部赡芫哂卸拘?，?duì)生命體構(gòu)成嚴(yán)重威脅，例如全球每年有100萬人死于鉛中毒，數(shù)百萬人（尤其是兒童）接受低劑量鉛暴露導(dǎo)致終身健康問題，因此重金屬污染控制一直是全球關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)用于重金屬祛除的物理和化學(xué)方法，成本相對(duì)高、周期比較長、且非選擇性。生物修復(fù)法通過生物過程對(duì)重金屬污染物進(jìn)行降解或還原，具有底物多樣性，效率更高且成本較低，成為一個(gè)新興熱點(diǎn)。

2、一些微生物在有毒重金屬存在時(shí)也能生長，因而可用于清除污染區(qū)重金屬，保護(hù)人類生存環(huán)境。微生物可與金屬相互作用，通過生物吸附、生物蓄積、氧化還原、抗性基因表達(dá)等不同生物學(xué)過程來改變重金屬的狀態(tài)，對(duì)可溶態(tài)和不溶態(tài)的有毒有害重金屬進(jìn)行修復(fù)。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌和藻類均對(duì)各類重金屬土壤或廢水具有不同的解毒能力。然而，對(duì)篩選的天然菌株進(jìn)行改造修飾，獲得特殊條件下重金屬的緩解或祛除能力，研究還很少。例如改造極端微生物，使其在強(qiáng)輻照或高氧化環(huán)境下，仍然具有很強(qiáng)的重金屬耐受性。因此利用天然特色微生物，構(gòu)建重金屬吸附重組菌株，在有害重金屬去除方面具有巨大潛力。

3、火星被譽(yù)為地球的“孿生姐妹”，成為未來人類太空移民的首選地。如果要向火星進(jìn)軍，需要解決在火星土地上種植的問題。然而火星土壤中的鎘、汞等有毒重金屬很高，會(huì)通過種植作物進(jìn)入人體，將成為在火星上種植可食植物的障礙。火星表面具有高輻射和氧化劑等細(xì)胞毒性物質(zhì)，因此培育能減輕甚至消除重金屬毒性的耐輻射生物吸附劑，對(duì)未來空間生物學(xué)的發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)目前能高效吸附重金屬的抗輻射細(xì)菌的缺乏，以及未來對(duì)于這種細(xì)菌的潛在需求，本發(fā)明深入挖掘重金屬吸附基因元件和抗輻射細(xì)菌的特性，提供了一種鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明以迄今為止發(fā)現(xiàn)的地球上最耐輻射且具有強(qiáng)抗氧化能力的細(xì)菌為母體，構(gòu)建了重金屬吸附的加強(qiáng)型重組菌株，從而提供了一種耐輻射的基因工程極端微生物，在減輕特殊強(qiáng)氧化性和高輻射區(qū)的農(nóng)作物鎘鉛等重金屬毒性方面具有應(yīng)用價(jià)值。

2、一種鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌，耐輻射奇球菌 d.?radiodurans含有重組質(zhì)粒prad-p8-lpp-ompa-pbbd?-mtt5，從而兼具吸附重金屬和抗輻射能力；所述的p8-lpp-ompa-pbbd-mtt5為表達(dá)模塊，dna序列如seq?id?no.13所示。

3、所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的構(gòu)建方法，步驟如下：

4、1）以目標(biāo)菌株耐輻射奇球菌 d.?radiodurans的近緣物種沙漠奇球菌( deinococcus?deserti)啟動(dòng)子序列為原型，利用報(bào)告基因mcherry的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，篩選得到適于在耐輻射奇球菌中表達(dá)的超強(qiáng)組成型啟動(dòng)子元件p8，dna序列如seq?id?no.12所示。

5、2）分別以大腸桿菌 escherichia?coli、耐金屬貪銅菌 cupriavidus? metallidurans的基因組dna為模板，克隆獲得相應(yīng)的內(nèi)膜定位肽段lpp-ompa、特異性重金屬鉛結(jié)合蛋白pbbd的基因片段，并且合成嗜熱四膜蟲 tetrahymena?thermophila的鎘金屬硫蛋白mtt5的基因片段，然后連接啟動(dòng)子元件p8，形成p8-lpp-ompa-pbbd-mtt5表達(dá)模塊；

6、3）將所述的表達(dá)模塊定向整合到穿梭載體pradk中，獲得重組質(zhì)粒prad-8-lpp-ompa-?pbbd?-mtt5，并轉(zhuǎn)入耐輻射奇球菌 d.?radiodurans?r1，得到鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌lopm。

7、所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的應(yīng)用，細(xì)胞處理水稻根系，共培養(yǎng)，降低根系和地上部分的鎘鉛含量。

8、所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的應(yīng)用，用于吸附高輻射區(qū)或強(qiáng)氧化區(qū)的高濃度重金屬離子。

9、用于改良外星球表面土壤的過量重金屬。

10、所述的外星球?yàn)榛鹦恰?/p>

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

12、絕大多數(shù)鎘鉛等重金屬吸附細(xì)菌不抗輻射和強(qiáng)氧化劑，無法在輻射和/或強(qiáng)氧化環(huán)境下生存并吸附重金屬，而本發(fā)明所制備的一種強(qiáng)鎘鉛重金屬吸附劑能夠在輻射和/或強(qiáng)氧化環(huán)境下對(duì)鎘鉛等重金屬進(jìn)行吸附，處理水稻根系，共培養(yǎng)后可分別將根系和地上部分的鎘含量降至47.0%和43.4%，鉛含量降至55.4%和26.9%。本發(fā)明針對(duì)未來改良含有高濃度重金屬的高輻射/強(qiáng)氧化區(qū)和火星表面等土壤提供了一種可能的選擇。

1.?一種鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌，其特征在于，耐輻射奇球菌d.?radiodurans含有重組質(zhì)粒prad-p8-lpp-ompa-pbbd?-mtt5，從而兼具吸附重金屬和抗輻射能力；所述的p8-lpp-ompa-pbbd-mtt5為表達(dá)模塊，序列如seq?id?no.13所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，細(xì)胞處理水稻根系，共培養(yǎng)，降低根系和地上部分的鎘鉛含量。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，用于吸附高輻射區(qū)或強(qiáng)氧化區(qū)的高濃度重金屬離子。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的應(yīng)用，，其特征在于，用于改良外星球表面土壤的過量重金屬。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于，所述的外星球?yàn)榛鹦恰?/p>
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種鎘鉛重金屬吸附重組細(xì)菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。將大腸桿菌Escherichia?coli的內(nèi)膜定位肽段LPP?OmpA、耐金屬貪銅菌Cupriavidus?metallidurans的特異性重金屬結(jié)合蛋白PbBD和MTT5進(jìn)行融合，并導(dǎo)入耐輻射奇球菌Deinococcus?radiodurans?R1基因組，構(gòu)建出新的基因工程菌株。所得菌株兼具耐高輻射、抗強(qiáng)氧化和高重金屬吸收能力，在減輕強(qiáng)氧化性和高輻射等特殊區(qū)域的農(nóng)作物鎘鉛等重金屬毒性方面具有應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：王梁燕,戴商,王斌強(qiáng),田兵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19