本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取與分離，具體涉及的是一種通過微生物發(fā)酵法獲得黑木耳多糖的方法。

背景技術(shù)：

1、黑木耳是一種營養(yǎng)豐富、食藥用價值高的大型食用真菌，廣泛應(yīng)用于食品、保健品和中藥領(lǐng)域。近年來，黑木耳在吉林、黑龍江、河南、湖北等省大面積栽培，產(chǎn)量居世界蘑菇產(chǎn)量第四位。黑木耳子實體中含有多種生物活性物質(zhì)，其中多糖是一類重要的功能性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種活性，這些功能與黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)有關(guān)，因此，通過不同的方法提取黑木耳多糖，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及功能評價已成為研究熱點。

2、黑木耳多糖的提取過程主要包括原料的預(yù)處理、多糖的提取及純化等步驟。目前為了提高黑木耳多糖的產(chǎn)量，通常采用水提法、酶解法和酸堿提取法獲得多糖，這些方法在一定程度上優(yōu)化了黑木耳多糖的提取方案，但是所獲得的多糖種類有限，大多數(shù)都是黑木耳中原有的多糖組分，缺少對新型黑木耳多糖充分的挖掘，這是因為這些方法多數(shù)都是物理的方法，沒有改變多糖的組成和結(jié)構(gòu)。而本發(fā)明的特色在于充分利用冠突散囊菌，該菌株在代謝過程中分泌多種酶，包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶。由于酶的專一性，冠突散囊菌可降解果膠、半纖維素和纖維素等，從而破壞致密的細(xì)胞壁，使壁內(nèi)的多糖從更為疏散的結(jié)構(gòu)中溶出，從而獲得較高的提取率；同時由于這些復(fù)合酶對細(xì)胞壁的降解，也會有新的可溶性多糖形成。因此，通過冠突散囊菌發(fā)酵黑木耳多糖聯(lián)合超聲處理，以實現(xiàn)高效、簡便、穩(wěn)定的黑木耳多糖提取方法，提高黑木耳多糖的得率和生物活性，滿足工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用的需求。此外，微生物發(fā)酵技術(shù)的引入也有助于多糖的提取，發(fā)酵過程中微生物分泌的酶類能夠有效降解細(xì)胞壁，提高多糖的釋放率，并且在這一過程中，還可以改變底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提高基質(zhì)的生物利用度和生物活性。微生物發(fā)酵具有很多優(yōu)點，如特異性高、副產(chǎn)物少、操作簡便、對環(huán)境友好等。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明創(chuàng)新性地提出了一種利用冠突散囊菌發(fā)酵從黑木耳子實體中提取多糖的方法。通過優(yōu)化發(fā)酵條件、引入超聲波輔助提取，并結(jié)合多步純化工藝，顯著提高了黑木耳多糖的提取效率和純度，這些多糖在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等方面的生物活性顯著提高。該技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，不僅為黑木耳多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持，同時也為其在食品、藥品和保健品中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)，具有操作簡便、得率高的優(yōu)點。

2、本發(fā)明所提供的一種利用冠突散囊菌發(fā)酵制備黑木耳多糖的方法，具有以下有益效果：

3、1、本發(fā)明結(jié)合微生物發(fā)酵與超聲波輔助提取技術(shù)，顯著提高了黑木耳多糖的提取效率。發(fā)酵過程利用冠突散囊菌分泌的酶類，預(yù)先降解黑木耳細(xì)胞壁，促進(jìn)多糖的釋放；而超聲波處理通過空化效應(yīng)進(jìn)一步破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速多糖的溶出。相比傳統(tǒng)的提取方法，如水提法高溫提取耗時長、酶解法成本高，本發(fā)明的提取效率高，能耗低，成本低。

4、2、本發(fā)明的多步純化工藝，包括等電點法除蛋白、離心分離、醇沉以及透析，確保了多糖的高純度。將ph調(diào)節(jié)至等電點使得溶液中蛋白質(zhì)析出，乙醇沉淀步驟有效地濃縮和純化了多糖，透析去除小分子雜質(zhì)。最終得到的黑木耳多糖純度較高，適合在食品、醫(yī)藥和保健品中應(yīng)用。

5、3、本發(fā)明的提取方法工藝流程簡潔明了，所用設(shè)備簡單易得，操作過程易于控制，適合大規(guī)模生產(chǎn)。此外，工藝參數(shù)優(yōu)化后，提取過程中的條件穩(wěn)定，可重復(fù)性強，能夠確保不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量一致性。

6、4、降低生產(chǎn)成本

7、本發(fā)明通過優(yōu)化工藝流程，減少了提取和純化過程中所需的時間和化學(xué)試劑用量，從而降低了整體生產(chǎn)成本。

8、5、適用范圍廣泛

9、本發(fā)明不僅適用于黑木耳多糖的提取，還可推廣應(yīng)用于其他食用菌或植物多糖的提取和純化，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種利用冠突散囊菌發(fā)酵制備黑木耳多糖，方法及應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵法所使用的菌株為冠突散囊菌，該菌株具有產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的能力。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黑木耳粉末粒度為80目，按料液比1:2～1:10加入蒸餾水，滅菌后的黑木耳料濕度適中，適合于冠突散囊菌進(jìn)行好氧發(fā)酵。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冠突散囊菌菌懸液的接種比例為黑木耳混合物質(zhì)量的5％(v/w)，菌懸液濃度為1×106cfu/ml，發(fā)酵時間為6d。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵6d后所得的發(fā)酵料樣品再按料液比1:20～1:100加入蒸餾水，攪拌均勻，于200～400w、40～80℃超聲波處理20～40min，以進(jìn)一步破壞細(xì)胞壁；再用0.1mol/l?naoh溶液調(diào)節(jié)ph至9～11，磁力攪拌0.5～2h，，使細(xì)胞內(nèi)容物徹底釋放；然后離心10～30min(6796×g)，收集上清液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將上一步得到的上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積的1/4～1/8，用0.1mol/l?hcl溶液調(diào)節(jié)ph至2.0～5.0，于4℃冰箱中放置12～36h，以沉淀蛋白質(zhì)，離心10～30min(6796×g)，收集上清液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乙醇沉淀步驟在4℃下進(jìn)行，以降低多糖的溶解度，從而有效沉淀多糖。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，多糖濃度在0～2mg/ml范圍內(nèi)，對α-淀粉酶抑制率、dpph自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、abts+自由基清除率、總還原力隨濃度的增加而增加，發(fā)酵后的黑木耳多糖優(yōu)于未發(fā)酵的多糖，且有顯著性差異(p＜0.05)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，黑木耳多糖濃度在12.5～800μg/ml范圍內(nèi)，raw264.7細(xì)胞存活率、吞噬指數(shù)、氧化損傷的raw264.7細(xì)胞存活率、隨濃度的增加而增加，發(fā)酵后的黑木耳多糖優(yōu)于未發(fā)酵的多糖，且有顯著性差異(p＜0.05)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，黑木耳多糖濃度在12.5～800μg/ml范圍內(nèi)，對raw264.7細(xì)胞il-10、il-1β、il-6、tnf-α釋放量隨濃度的增加而增加，發(fā)酵后的黑木耳多糖優(yōu)于未發(fā)酵的多糖(p＜0.05)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種利用冠突散囊菌發(fā)酵制備黑木耳多糖的方法。將黑木耳粉碎并過篩，再與蒸餾水混合后，進(jìn)行高壓滅菌。冷卻后，加入5%（v/w）的冠突散囊菌，28℃下發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，加入蒸餾水，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理。隨后，調(diào)節(jié)pH至9~11，磁力攪拌0.5~2?h后離心分離，收集上清液并濃縮至原體積的1/4?1/8。將其pH調(diào)至2.0~5.0，4℃冰箱中冷沉12~36?h，再次離心，收集上清液并加入無水乙醇沉淀多糖。最后，將沉淀物凍干，得到黑木耳多糖。發(fā)酵多糖得率為8.175%，在2.0?mg/mL時，對DPPH、超氧陰離子自由基的清除率分別為63.74%和57.11%，α?淀粉酶抑制率為69.57%。本發(fā)明工藝簡單，所得到的黑木耳多糖得率和生物學(xué)活性較高，適合大規(guī)模生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：孫慶申,馬華美,孫昕,趙依茹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：黑龍江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19