本發(fā)明涉及生物，尤其是涉及一種alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、如下陳述僅提供與本發(fā)明有關(guān)的背景信息，而不必然地構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。

2、alport綜合征(alport?syndrome，as)是一種由編碼ⅳ型膠原蛋白α3、α4、α5鏈的col4a3、col4a4和col4a5基因突變導(dǎo)致的遺傳性腎病。主要表現(xiàn)為腎功能的進(jìn)行性損害，部分患者合并有腎外器官損傷，但影響alport綜合征的預(yù)后的因素及其分子機(jī)制仍不清晰。ⅳ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致腎小球基底膜功能障礙，從而引起蛋白尿、血尿。部分患者還會出現(xiàn)腎外癥狀，如感音神經(jīng)性聽力損失和眼部異常。alport綜合征的預(yù)后通常較差，目前尚無治愈方法。早期應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(acei)和血管緊張素受體拮抗劑(arb)可以延緩患者發(fā)展為腎衰竭。

3、人群中col4a5基因突變型的alport綜合征患者數(shù)占總數(shù)的80％～85％，少部分為col4a3、col4a4基因突變型alport綜合征。col4a5基因位于x染色體上，因此x染色體連鎖的alport綜合征(x-linked?alport?syndrome，簡稱xlas)在男性中更常見，臨床表現(xiàn)也更重，幾乎100％均會進(jìn)入終末期腎病。盡管致病基因已知，但現(xiàn)階段影響alport綜合征發(fā)病與預(yù)后的分子機(jī)制仍不明確。

4、既往研究表明，x連鎖的alport綜合征的預(yù)后與基因突變類型密切相關(guān)。col4a5基因的突變類型，如剪接位點(diǎn)突變、外顯子序列的缺失和插入等突變，是影響alport綜合征發(fā)病的重要因素。jais等人發(fā)現(xiàn)，具有大片段缺失和無義突變的患者在30歲時(shí)發(fā)展為終末期腎病的概率為90％，而具有剪接位點(diǎn)突變的患者風(fēng)險(xiǎn)為70％，錯義突變的風(fēng)險(xiǎn)為50％。bekheirnia等人研究發(fā)現(xiàn)，接近5′末端的突變會導(dǎo)致alport綜合征更快進(jìn)展為esrd，具有錯義突變的alport綜合征患者esrd發(fā)病平均年齡為37歲，具有剪接位點(diǎn)突變者為28歲，具有截短突變者為25歲10。以上研究發(fā)現(xiàn)基因突變類型與alport綜合征的發(fā)病年齡與預(yù)后密切相關(guān)。但由于基因突變種類繁多，alport綜合征患者的基因型-表型相關(guān)性，及其中的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

5、建立alport綜合征的有效動物模型對于探索不同突變類型導(dǎo)致的預(yù)后差異以及開發(fā)新的靶向藥物具有重要意義。不同突變類型動物模型的疾病表征存在明顯差異，現(xiàn)階段多種遺傳方式的alport綜合征小鼠模型的構(gòu)建為其發(fā)病機(jī)制的探索提供了更多平臺。然而，目前已有的小鼠模型主要是col4a3基因的突變型，雖然人群中col4a5基因突變型alport綜合征更常見，但基礎(chǔ)研究領(lǐng)域少有col4a5突變型alport綜合征小鼠模型。

6、目前報(bào)道的三種col4a5基因突變的小鼠模型有三種，均是通過col4a5基因的外顯子突變引起alport綜合征的小鼠模型，分別為攜帶無義突變g5x、r471x以及atgg缺失引起的移碼突變。rheault等人和kentarou?hashikami等人構(gòu)建的col4a5基因外顯子點(diǎn)突變的小鼠模型(突變位點(diǎn)分別為g5x、r471x)，該突變會導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，進(jìn)而影響col4a5膠原的合成。wei-qing?wu等人證實(shí)atgg缺失引起的錯位突變會導(dǎo)致col4a5膠原功能異常。提供更多種類的col4a5基因突變型alport綜合征動物模型有助于為進(jìn)一步探索alport綜合征的異質(zhì)性提供可靠的臨床研究工具。

7、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中缺乏col4a5基因突變型alport綜合征動物模型的問題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明特采用如下技術(shù)方案：

3、第一方面，提供了一種alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括使受試動物的col4a5基因發(fā)生對應(yīng)于alport綜合征患者的col4a5-c.1517-1g>t突變。

4、可選的實(shí)施方式中，所述受試動物包括哺乳動物。

5、可選的實(shí)施方式中，所述受試動物為小鼠，以ensmust00000112931.7轉(zhuǎn)錄本為參考序列，進(jìn)行col4a5-c.1517-1g>t突變。

6、可選的實(shí)施方式中，所述alport綜合征動物模型相比于未經(jīng)突變的受試動物具有如下(ⅰ)-(ⅵ)中的一種或多種性質(zhì)：

7、(ⅰ)尿蛋白/肌酐比值升高；

8、(ⅱ)血清中的尿素氮和肌酐水平升高；

9、(ⅲ)腎小球形態(tài)異常；

10、(ⅳ)腎小管刷狀緣萎縮和/或消失；

11、(ⅴ)足細(xì)胞數(shù)量減少；

12、(ⅵ)腎臟間質(zhì)中發(fā)生免疫細(xì)胞浸潤。

13、可選的實(shí)施方式中，所述構(gòu)建方法包括使用基因編輯系統(tǒng)使受試動物的col4a5基因發(fā)生突變。

14、可選的實(shí)施方式中，通過至少一種crispr/cas基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行了基因編輯。

15、可選的實(shí)施方式中，所述crispr/cas基因編輯系統(tǒng)包括(ⅰ)～(ⅲ)中的一種或多種：

16、(ⅰ)靶向目的片段的sgrna，或編碼所述sgrna的多核苷酸；

17、(ⅱ)供體dna，或編碼所述供體dna的多核苷酸；

18、(ⅲ)cas核酸酶，或編碼cas核酸酶的多核苷酸。

19、可選的實(shí)施方式中，所述受試動物為小鼠，sgrna包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的sgrna1和核苷酸序列如seq?id?no.2所示的sgrna2，供體dna的核苷酸序列如seq?idno.3所示。

20、第二方面，提供了一種用于構(gòu)建alport綜合征動物模型的試劑盒，所述動物模型為小鼠，所述試劑盒包括(ⅰ)～(ⅲ)中的一種或多種：

21、(ⅰ)靶向目的片段的sgrna，或編碼所述sgrna的多核苷酸；sgrna包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的sgrna1和核苷酸序列如seq?id?no.2所示的sgrna2；

22、(ⅱ)供體dna，或編碼所述供體dna的多核苷酸；供體dna的核苷酸序列如seq?idno.3所示；

23、(ⅲ)cas核酸酶，或編碼cas核酸酶的多核苷酸。

24、可選的實(shí)施方式中，所述cas核酸酶包括cas9、cpf1、c2c1、c2c2、c2c3、hf?cas9、cas12a、cas12b、sacas9或spcas9。

25、第三方面，還提供了第一方面的alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法，或第二方面的用于構(gòu)建alport綜合征動物模型的試劑盒在制備預(yù)防和/或緩解alport綜合征的藥物中的應(yīng)用。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

27、本發(fā)明提供了一種新的col4a5col4a5基因突變引起的alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法，通過使受試動物發(fā)生對應(yīng)于alport綜合征患者的col4a5-c.1517-1g>t突變，使制備得到的動物模型具有如下至少一種性質(zhì)：(ⅰ)尿蛋白/肌酐比值升高；(ⅱ)血清中的尿素氮和肌酐水平升高；(ⅲ)腎小球形態(tài)異常；(ⅳ)腎小管刷狀緣萎縮和/或消失；(ⅴ)足細(xì)胞數(shù)量減少；(ⅵ)腎臟間質(zhì)中發(fā)生免疫細(xì)胞浸潤。該構(gòu)建方法首次制備出能夠使腎臟有大量免疫細(xì)胞浸潤的伴x染色體連鎖遺傳的動物模型，該alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法為進(jìn)一步探索alport綜合征的異質(zhì)性提供了可靠的臨床研究工具。同時(shí)也是迄今為止報(bào)道的第一個(gè)由剪切突變引起的伴x染色體隱性遺傳的alport綜合征動物模型的構(gòu)建方法。