本發(fā)明涉及微生物工程，具體涉及一種拜氏梭菌耐氧突變菌株及其制備方法和應用。

背景技術：

1、生物丁醇因其優(yōu)良的燃料特性，成為繼生物乙醇之后，備受關注的一種新型可再生清潔生物質能源。生物丁醇主要的工業(yè)化生產方式是厭氧梭菌abe發(fā)酵(acetonebutanol?and?ethanol?fermentation)，但相對石油化工法來源的丁醇，生物丁醇因存在產量、生產效率、原料轉化率較低，導致的生產成本較高問題，使得其市場競力不足。其中，o2和活性氧(reactive?oxygen?species，ros)對厭氧梭菌氧化還原代謝的致死性損傷，導致厭氧梭菌只能在絕對厭氧的環(huán)境生長，這是“工業(yè)菌株遺傳改良”和“abe發(fā)酵生產”成本增加的重要因素。

2、丙酮丁醇梭菌(clostridium?acetobutylicum)atcc?824和拜氏梭菌(clostridium?beijerinckii)ncimb?8052是當前用于abe發(fā)酵最主要的兩株工業(yè)菌種。但前者所有與產丁醇相關的遺傳信息都位于其染色體外的兆質粒psol1上，容易在傳代過程中因質粒丟失導致產丁醇性能退化；且前者含有cac824i二型限制修飾系統，遺傳操作時需對外源dna進行甲基化修飾，步驟繁瑣。而后者拜氏梭菌ncimb?8052無以上兩個缺點，具有更好的遺傳穩(wěn)定性和遺傳可操作性。通過遺傳改造優(yōu)化產溶劑梭菌abe發(fā)酵性能，一直是降低生物丁醇生產成本的重要課題。

3、dong?et?al.(2011)研究發(fā)現，perr(peroxide?repressor)蛋白是調控丙酮丁醇梭菌atcc?824清除o2和ros氧化應激防御系統功能基因的關鍵抑制子，敲除atcc?824中perr編碼基因ca_c2634后，丙酮丁醇梭菌對氧的耐受性顯著增強。而目前尚未有對于拜氏梭菌的相關研究報道。基于上述背景，開發(fā)拜氏梭菌的耐氧突變菌株具有現實價值。

技術實現思路

1、針對上述需求，本發(fā)明目的在于提供一種拜氏梭菌的耐氧突變菌株、及其制備方法及應用，本發(fā)明提供的拜氏梭菌是產溶劑性能顯著提高的兼性厭氧突變株，不但能在厭氧條件生長，也能在有氧的空氣中良好生長。

2、本發(fā)明首先提供了一種拜氏梭菌耐氧突變菌株，突變株為拜氏梭菌的perr蛋白編碼基因cbei_1336缺失或失活的突變。

3、在根據本發(fā)明的一個實施方案中，所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，其以拜氏梭菌ncimb?8052產溶劑退化株為基礎菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達，進而所得菌株；優(yōu)選地，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達的手段為crispr/cas9基因同框缺失、crispr/cas12a基因同框缺失、clostron二型內含子插入的基因失活或同源重組等的基因編輯技術。

4、本發(fā)明還提供了一種拜氏梭菌耐氧突變菌株的構建方法，其包括：以拜氏梭菌為出發(fā)菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達，進而所得菌株；優(yōu)選地，所述基礎菌株為拜氏梭菌ncimb?8052產溶劑退化株。

5、在根據本發(fā)明的一個實施方案中，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達的手段優(yōu)選為crispr/cas9基因同框缺失、crispr/cas12a基因同框缺失、clostron二型內含子插入的基因失活或同源重組等基因編輯技術；優(yōu)選為clostron二型內含子定點插入的基因失活。

6、在根據本發(fā)明的一個實施方案中，其中，所述通過二型內含子插入的基因失活是通過包括下述步驟的方法實現的：

7、1)構建含有特異性clostron二型內含子片段的敲除載體；

8、2)將敲除載體轉化入拜氏梭菌目標菌株中；

9、3)傳代、篩選和鑒定，獲得拜氏梭菌耐氧突變菌株。

10、在根據本發(fā)明的一個實施方案中，步驟1)中所述敲除載體是通過包括下述步驟的方法構建的：

11、a)以intron?pcr?template為模板，以ibs、ebs1d、ebs2和ebs?universal為引物進行pcr擴增得到特異片段；

12、所述ibs的核苷酸序列為seq?id?no:1；ebs1d的核苷酸序列為seq?id?no:2；ebs2的核苷酸序列為seq?id?no:3；ebs?universal的核苷酸序列為seq?id?no:4；

13、b)利用限制性內切酶hindiii和bsrgi雙酶切消化所述特異片段和敲除穿梭質粒；優(yōu)選地，所述穿梭質粒為pmtl007；

14、c)以t4連接酶連接消化后的片段和質粒，得到敲除載體。

15、本發(fā)明的另一方面，提供了一種敲除載體，其包含特異性clostron二型內含子片段和穿梭質粒；所述特異性clostron二型內含子片段以intron?pcr?template為模板，以ibs、ebs1d、ebs2和ebs?universal為引物進行pcr擴增得到的；其中，所述ibs的核苷酸序列為seq?id?no:1；ebs1d的核苷酸序列為seq?id?no:2；ebs2的核苷酸序列為seq?id?no:3；ebs?universal的核苷酸序列為seq?id?no:4。

16、在根據本發(fā)明的再一方面中，本發(fā)明還提供了上述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，或根據上述的構建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生產生物丁醇中的應用。

17、本發(fā)明另外還提供了一種生產生物丁醇的方法，其利用權利要求上述拜氏梭菌耐氧突變菌株,或根據上述的構建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生物丁醇生產設備中進行厭氧發(fā)酵。

18、本發(fā)明的上述技術方案的有益效果如下：

19、1、本發(fā)明提供的方法通過二型內含子定點插入法敲除了拜氏梭菌的perr蛋白編碼基因，能夠穩(wěn)定地獲得表達缺失型突變菌株；

20、2、本發(fā)明提供的拜氏梭菌突變株不但能在厭氧條件生長，也能在有氧的空氣中生長良好；

21、3、本發(fā)明提供的拜氏梭菌突變株具有優(yōu)良的耐氧性，且產溶劑丁醇和丙酮性能顯著提高，且發(fā)酵周期縮短了24小時。

技術特征：

1.一種拜氏梭菌耐氧突變菌株，突變株為拜氏梭菌的perr蛋白編碼基因cbei_1336因定點插入失活的突變。

2.如權利要求1所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，其以拜氏梭菌ncimb?8052產溶劑退化株為基礎菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達，進而所得菌株；優(yōu)選地，所述阻斷其perr蛋白編碼基因采用clostron二型內含子定點插入的基因失活的基因編輯技術。

3.如權利要求1或2所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達的手段為clostron二型內含子定點插入的基因失活的基因編輯技術。

4.一種拜氏梭菌耐氧突變菌株的構建方法，其包括：以拜氏梭菌為基礎菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達，進而所得菌株；優(yōu)選地，所述基礎菌株為拜氏梭菌ncimb?8052產溶劑退化株。

5.如權利要求4所述的構建方法，其中，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達的手段為clostron二型內含子插入的基因失活的基因編輯技術；優(yōu)選為clostron二型內含子定點插入的基因失活。

6.如權利要求5所述的構建方法，其中，所述通過二型內含子定點插入的基因失活是通過包括下述步驟的方法實現的：

7.如權利要求6所述的構建方法，其中，步驟1)中所述敲除載體是通過包括下述步驟的方法構建的：

8.一種敲除載體，其特征在于，包含特異性clostron二型內含子片段和穿梭質粒；所述特異性clostron二型內含子片段以intron?pcr?template為模板，以ibs、ebs1d、ebs2和ebsuniversal為引物進行pcr擴增得到的；其中，所述ibs的核苷酸序列為seq?id?no:1；ebs1d的核苷酸序列為seq?id?no:2；ebs2的核苷酸序列為seq?id?no:3；ebs?universal的核苷酸序列為seq?id?no:4。

9.如權利要求1-3中任一項所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，或根據權利要求4-7中任一項所述的構建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生產生物丁醇中的應用。

10.一種生產生物丁醇的方法，其特征在于：利用權利要求1-3任一項所述拜氏梭菌耐氧突變菌株,或根據權利要求4-7中任一項所述的構建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生物丁醇生產設備中進行厭氧發(fā)酵。

技術總結
本發(fā)明提供了一種拜氏梭菌耐氧突變菌株及其構建方法和應用，本發(fā)明提供了拜氏梭菌突變菌株為PerR蛋白編碼基因Cbei_1336因定點插入而失活的突變體。該突變菌株不但能在厭氧條件生長，也能在有氧的空氣中良好生長，耐氧且產溶劑丁醇和丙酮性能顯著提高，且發(fā)酵周期縮短了24小時。

技術研發(fā)人員：肖川,饒賢才,豆建雄
受保護的技術使用者：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19