本發(fā)明屬于微生物，具體涉及一種防治番茄典型病害的微生物菌劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、番茄(lycopersicon?esculentum?mill.)，茄科番茄屬(solanaceae)。番茄原產(chǎn)于南美洲地區(qū)，含有多種對(duì)人體有益的維生素、礦物元素和纖維素，有抗衰老、減少癌癥發(fā)生的功效，在醫(yī)療、食品、保健等領(lǐng)域有著巨大的發(fā)展前景。

2、目前番茄各地普遍種植，栽培面積逐年擴(kuò)大。在栽種過程中病害種類較多且較重。病害發(fā)生使得西紅柿產(chǎn)量及質(zhì)量下降，給農(nóng)民造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。番茄的常發(fā)病害主要有灰霉病、早疫病、葉霉病、病毒病、青枯病、晚疫病、線蟲病、潰瘍病等。隨著種植面積的不斷擴(kuò)大及多年連作，病害發(fā)生逐步加重，新病害相繼出現(xiàn)，且常常多種病害同時(shí)發(fā)生，給防治加大了難度。

3、微生物菌劑是一種利用微生物及其生命活動(dòng)的產(chǎn)物，具有直接或間接改良土壤、恢復(fù)地力、預(yù)防各種植物病害、維持根際微生物區(qū)系平衡和降解有毒害物質(zhì)等的作用，利用微生物菌劑可降低致病菌的抗藥性，且對(duì)果品安全健康，對(duì)環(huán)境無污染。目前針對(duì)番茄病害研究的微生物菌劑大多是針對(duì)番茄的某一種常見病害具有較好的防治效果，無法同時(shí)對(duì)多種病蟲害同時(shí)達(dá)到高效的防治效果。例如中國(guó)專利cn104087541a其公開了一種防治番茄早疫病的生防菌株及其應(yīng)用，中國(guó)專利cn103952352a中公開了一種環(huán)狀芽孢桿菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用，其主要對(duì)番茄灰霉病具有良好的防治效果。雖然之類微生物菌株對(duì)于番茄某一類病害具有明顯的防治效果，但是在實(shí)際生產(chǎn)中，番茄的各類病害并不是單獨(dú)產(chǎn)生的，在生長(zhǎng)過程中，可能會(huì)同時(shí)伴隨著多種病害。因此這類微生物菌劑，功能單一，在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，很難得到有效的利用和推廣。因此開發(fā)一種新的微生物菌劑用于防治番茄多種病害，是目前亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種防治番茄典型病害的微生物菌劑及其制備方法，將微生物菌劑進(jìn)行合理的復(fù)配使用，使真菌和細(xì)菌協(xié)同作用，有效防治多種番茄典型病害。

2、為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、一種防治番茄典型病害的微生物菌劑，包括以下成分：漸綠木霉菌(trichodermaviridescens)、鉤狀木霉菌(trichoderma?hamatum)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、褐球固氮菌(azotobacter?chroococcum)，體積比為1:1:1:1；

4、所述漸綠木霉菌購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，菌株編號(hào)為cgmcc?no.5.1040；原始保藏時(shí)間為2005年8月8日；

5、所述鉤狀木霉菌購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，菌株編號(hào)為cgmcc?no.3.7249；原始保藏時(shí)間為2005年7月8日；

6、所述地衣芽孢桿菌購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，菌株保藏編號(hào)為cgmcc?no.1.7677；原始保藏時(shí)間為2008年6月24日；

7、所述褐球固氮菌購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，菌株編號(hào)為cgmcc?no.1.5803；原始保藏時(shí)間為2005年6月27日。

8、本發(fā)明所用四種微生物菌株均可通過中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心菌株目錄查詢購(gòu)買，無需進(jìn)行重復(fù)生物保藏。

9、優(yōu)選的，所述微生物菌劑為液劑。

10、優(yōu)選的，所述漸綠木霉菌的孢子數(shù)為2×108cfu/ml；所述鉤狀木霉菌的孢子數(shù)為2×108cfu/ml；所述微生物菌劑中地衣芽孢桿菌活菌量為2×108cfu/ml，褐球固氮菌活菌量為2×108cfu/ml。

11、一種防治番茄典型病害的微生物菌劑的制備方法，包括以下制備步驟：

12、(1)將漸綠木霉菌、鉤狀木霉菌試管斜面菌種活化，挑取菌種分別放入裝有100ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，170r/min，25-28℃下培養(yǎng)48h，獲得種子液；將種子液按10％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，170r/min，25-28℃下培養(yǎng)96h，獲得培養(yǎng)液，此時(shí)培養(yǎng)液長(zhǎng)滿漸綠木霉和鉤狀木霉的菌絲和孢子，利用無菌水洗孢子，四層紗布過濾，分別再稀釋得到漸綠木霉菌液和鉤狀木霉菌液，保證稀釋后得到的兩種木霉菌液的孢子濃度都為2×108cfu/ml；

13、(2)將褐球固氮菌解凍后接種于pda培養(yǎng)基中，28℃進(jìn)行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)后，挑取1％的接種量加入至發(fā)酵培養(yǎng)液，25-28℃，150r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至獲得活菌量為2×108cfu/ml的發(fā)酵菌液；

14、(3)將地衣芽孢桿菌解凍后接種于lb固體培養(yǎng)基中，28-30℃培養(yǎng)1天，活化菌株；挑取活化后的地衣芽孢桿菌接種于lb液體培養(yǎng)基中，28-30℃，220r/min發(fā)酵培養(yǎng)，直至獲得活菌量為2×108cfu/ml的發(fā)酵菌液；

15、(4)將四種發(fā)酵菌液按照體積比1:1:1:1混合后，得到終產(chǎn)品微生物菌劑。

16、lb固體培養(yǎng)基采用常規(guī)培養(yǎng)基。

17、pda培養(yǎng)基制備方法：馬鈴薯200克，加水煮爛，過濾后取濾液，再加葡萄糖20克、瓊脂15-20克，加水至1000毫升，自然ph。

18、發(fā)酵培養(yǎng)液即馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(pdb)的組成：馬鈴薯300g/l，葡萄糖20g/l，蒸餾水加至1000ml，ph為5.6～5.8。

19、本發(fā)明微生物菌劑對(duì)番茄根腐病、灰霉病、枯萎病、早疫病具有良好的防治效果。

20、本技術(shù)的菌劑可在種子期使用，也可在植物成株期或種苗期灌根使用。制備的微生物菌劑稀釋100倍，每株使用25ml。連續(xù)使用2次，每次間隔10天。

21、本發(fā)明具有以下有益效果：

22、首先本發(fā)明復(fù)配漸綠木霉和鉤狀木霉，其對(duì)多種番茄致病菌具有拮抗作用，可以防治多種番茄典型病害。本發(fā)明篩選的漸綠木霉和鉤狀木霉，能夠分泌多種胞外酶，如纖維素酶、殼多糖酶等，這些酶可以降解病原菌的細(xì)胞壁，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)；同時(shí)其能夠產(chǎn)生多種揮發(fā)性和非揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌有明顯的抑菌作用；

23、其次引入地衣芽孢桿菌和褐球固氮菌，地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，直接抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)地衣芽孢桿菌能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，能顯著降低植物發(fā)病率；同時(shí)所選的地衣芽孢桿菌，褐球固氮菌具有良好的固氮能力，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高土壤養(yǎng)分含量，從而為其他植物促生菌提供更好的生長(zhǎng)環(huán)境，還能夠生成吲哚乙酸，溶磷活性和鐵載體生成等促進(jìn)植物生長(zhǎng)，有助于緩解病害對(duì)番茄產(chǎn)量的危害，促進(jìn)番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。同時(shí)該固氮菌對(duì)果蔬類灰霉病和枯萎病的病原菌有一定的抑制作用。

24、漸綠木霉和鉤狀木霉、地衣芽孢桿菌和褐球固氮菌聯(lián)合使用，相互促進(jìn)，對(duì)于番茄根腐病、灰霉病、枯萎病、早疫病病原菌呈現(xiàn)良好的協(xié)同抑制作用。真菌和細(xì)菌的協(xié)同，不僅解決了單一生防菌株的防治不穩(wěn)定、持續(xù)性弱的實(shí)際問題，還大大提高了生防效果，有效預(yù)防根腐病、灰霉病、枯萎病、早疫病等病害；另外此微生物菌劑能與土壤生態(tài)和諧相容，有利于充分發(fā)揮菌株的優(yōu)勢(shì)，有效保障和提高番茄產(chǎn)量。