本發(fā)明涉及生物化學(xué)，尤其是涉及一種rna解旋酶抑制劑的篩選方法。

背景技術(shù)：

1、rna解旋酶5是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的穿梭蛋白，屬于dead-box?rna解旋酶家族，具有atp依賴性的rna解旋活性。該蛋白在大多數(shù)組織和細(xì)胞中都有表達(dá)，在調(diào)控正常生理功能方面發(fā)揮作用。rna解旋酶5參與了幾乎所有的rna代謝過(guò)程，包括mrna的選擇性剪接、micro?rnas和核糖體的生物發(fā)生、mrna的降解、與長(zhǎng)鏈非編碼rna的相互作用以及轉(zhuǎn)錄活性的協(xié)同調(diào)節(jié)等。此外，rna解旋酶5的不同翻譯后修飾，如磷酸化、乙?；?、泛素化和sumo化，使其在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要的調(diào)節(jié)功能。當(dāng)rna解旋酶5的表達(dá)或其翻譯后修飾失調(diào)時(shí)，正常的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)就會(huì)崩塌，導(dǎo)致多種病理狀態(tài)的發(fā)生，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，rna解旋酶5在大部分腫瘤中具有高表達(dá)，且其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、及患者預(yù)后不良密切相關(guān)。抑制rna解旋酶5的活性，能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

2、rna解旋酶17屬于dead-box?rna解旋酶家族，具有atp依賴性的rna解旋活性，參與rna的加工和修飾，影響mrna的剪接和穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。rna解旋酶17能夠調(diào)節(jié)原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，因此與細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞增殖等過(guò)程密切相關(guān)。rna解旋酶17在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌等，其表達(dá)水平的增加可能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，rna解旋酶17能調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期控制、凋亡和dna損傷修復(fù)等。研究發(fā)現(xiàn)，rna解旋酶17的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，因此，rna解旋酶17被認(rèn)為是癌癥治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

3、開(kāi)發(fā)靶向rna解旋酶5或者rna解旋酶17活性的小分子抑制劑，有望成為一類新型的腫瘤靶向藥物。因此，開(kāi)發(fā)一種易于實(shí)施的高通量篩選rna解旋酶抑制劑的檢測(cè)方法具有重要的臨床及市場(chǎng)價(jià)值。

4、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種rna解旋酶抑制劑的篩選方法，以解決上述技術(shù)問(wèn)題。

2、為了實(shí)現(xiàn)以上目的，特采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種rna解旋酶抑制劑的篩選方法，采用adp-glotm激酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括以下步驟：

4、a.將rna解旋酶溶液和待測(cè)樣品溶液混合，進(jìn)行孵育；

5、b.a步驟孵育結(jié)束后添加含有dsrna和三磷酸腺苷的底物溶液進(jìn)行反應(yīng)；

6、c.b步驟反應(yīng)結(jié)束后添加adp?glo試劑終止反應(yīng)，并消耗掉多余的atp；

7、d.c步驟結(jié)束后添加激酶檢測(cè)試劑，將adp轉(zhuǎn)化成atp，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷待測(cè)樣品對(duì)rna解旋酶的抑制活性。

8、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，所述rna解旋酶包括rna解旋酶5或rna解旋酶17。

9、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，所述rna解旋酶溶液中rna解旋酶的濃度為18-22nm；

10、所述rna解旋酶溶液為含有rna解旋酶的緩沖液；

11、所述緩沖液為含有4-6mm的三羥甲基氨基甲烷、1.8-2.2mm的二硫蘇糖醇和9-11mm的mgcl2的水溶液；

12、所述rna解旋酶溶液和待測(cè)樣品溶液等體積混合。

13、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，所述待測(cè)樣品溶液的數(shù)量至少為1個(gè)，當(dāng)待測(cè)樣品溶液的數(shù)量大于1個(gè)時(shí)，各個(gè)待測(cè)樣品溶液的濃度不同。

14、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，a步驟中，所述孵育的溫度為24-28℃，時(shí)間為18-22min。

15、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，所述底物溶液中，dsrna的濃度為250-350nm，三磷酸腺苷的濃度為250-350μm；

16、所述底物溶液為水相溶液，還包括4-6mm的三羥甲基氨基甲烷、1.8-2.2mm的二硫蘇糖醇和9-11mm的mgcl2；

17、a步驟孵育后的溶液與底物溶液等體積混合。

18、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，b步驟中，所述反應(yīng)的ph為7-8，溫度為24-28℃，時(shí)間為110-130min。

19、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，所述rna解旋酶溶液與adpglo試劑的體積比為1：2；

20、添加adp?glo試劑50-70min后再進(jìn)行d步驟。

21、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，所述rna解旋酶溶液與激酶檢測(cè)試劑的體積比為1：4；

22、添加激酶檢測(cè)試劑50-70min后，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

23、作為進(jìn)一步技術(shù)方案，d步驟中，根據(jù)不同濃度待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度獲得待測(cè)樣本的半抑制濃度，然后判斷待測(cè)樣品對(duì)rna解旋酶的抑制活性。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

25、本發(fā)明提供的rna解旋酶抑制劑的篩選方法，穩(wěn)定可靠，靈敏度高，兼具高通量和普適性，能夠用于包括rna解旋酶5抑制劑和rna解旋酶17抑制劑的篩選相關(guān)酶促動(dòng)力學(xué)的研究。

技術(shù)特征：

1.一種rna解旋酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，采用adp-glotm激酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述rna解旋酶包括rna解旋酶5或rna解旋酶17。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述rna解旋酶溶液中rna解旋酶的濃度為18-22nm；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品溶液的數(shù)量至少為1個(gè)，當(dāng)待測(cè)樣品溶液的數(shù)量大于1個(gè)時(shí)，各個(gè)待測(cè)樣品溶液的濃度不同。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，a步驟中，所述孵育的溫度為24-28℃，時(shí)間為18-22min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述底物溶液中，dsrna的濃度為250-350nm，三磷酸腺苷的濃度為250-350μm；

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，b步驟中，所述反應(yīng)的ph為7-8，溫度為24-28℃，時(shí)間為110-130min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述rna解旋酶溶液與adpglo試劑的體積比為1：2；

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述rna解旋酶溶液與激酶檢測(cè)試劑的體積比為1：4；

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，d步驟中，根據(jù)不同濃度待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度獲得待測(cè)樣本的半抑制濃度，然后判斷待測(cè)樣品對(duì)rna解旋酶的抑制活性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種RNA解旋酶抑制劑的篩選方法，涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的RNA解旋酶抑制劑的篩選方法，采用ADP?Glo<supgt;TM</supgt;激酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括：a.將RNA解旋酶溶液和待測(cè)樣品溶液混合，進(jìn)行孵育；b.a步驟孵育結(jié)束后添加含有dsRNA和三磷酸腺苷的底物溶液進(jìn)行反應(yīng)；c.b步驟反應(yīng)結(jié)束后添加ADP?Glo試劑終止反應(yīng)，并消耗掉多余的ATP；d.c步驟結(jié)束后添加激酶檢測(cè)試劑，將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷待測(cè)樣品對(duì)RNA解旋酶的抑制活性。該篩選方法，穩(wěn)定可靠，靈敏度高，兼具高通量和普適性，能夠用于RNA解旋酶抑制劑篩選相關(guān)酶促動(dòng)力學(xué)的研究。

技術(shù)研發(fā)人員：吳朵,施松,賀虎
受保護(hù)的技術(shù)使用者：杭州圣域生物醫(yī)藥科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19