本發(fā)明涉及鹿茸菇多糖提取，具體為響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝。

背景技術(shù)：

1、鹿茸菇是一種珍貴的野生食藥兼用菌，鹿茸菇多糖是其主要活性成分之一，已被證實具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等功效?，F(xiàn)有的鹿茸菇多糖提取工藝包括熱水浸提法、水提醇沉法、微波萃取法和蒸汽爆破法，熱水浸提法和水提醇沉法雖然工藝簡單但普遍提取率低，微波萃取法和蒸汽爆破法等對設(shè)備要求較高，而且現(xiàn)有技術(shù)缺少獲取最佳的工藝參數(shù)的方法，因此提出一種響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，包括以下步驟：步驟一，確定鹿茸菇多糖提取方法；步驟二，標準曲線繪制；步驟三，鹿茸菇多糖提取率的測定；步驟四，單因素實驗；步驟五，響應面工藝優(yōu)化實驗；步驟六，最佳工藝條件驗證；

3、其中在上述步驟一中，將粉碎的鹿茸菇與蒸餾水充分混勻，調(diào)節(jié)ph后加入木瓜蛋白酶，再次充分混勻，滅酶過濾后離心取上清液，對濾渣進行酶提，對兩次獲取的上清液進行合并濃縮處理，然后加入95％的乙醇，靜置后離心得沉淀物，加蒸餾水溶解沉淀物，靜置后離心得上清液，加入95％乙醇至最后的酒精濃度為80％，靜置后離心得沉淀物，向沉淀物中加入95％乙醇攪拌，再次離心并除去乙醇，將沉淀物冷凍干燥得鹿茸菇多糖；

4、其中在上述步驟二中，通過配制不同濃度的葡聚糖標準溶液，加入試劑進行反應后，在特定波長下測定吸光度，以吸光度為橫坐標、葡聚糖質(zhì)量為縱坐標繪制標準曲線；

5、其中在上述步驟三中，取步驟一中制備的鹿茸菇多糖，按照步驟二的操作測定鹿茸菇多糖溶液吸光度，再計算出鹿茸菇多糖提取率；

6、其中在上述步驟四中，按照步驟一的操作，通過單因素實驗，得到不同工藝參數(shù)下制備的鹿茸菇多糖，再按照步驟三的操作分別計算出鹿茸菇多糖提取率，分析得出酶解溫度、酶解時間、酶解ph對鹿茸菇多糖提取率的影響較大；

7、其中在上述步驟五中，根據(jù)步驟四的分析結(jié)果，選取酶解溫度、酶解時間、酶解ph為實驗因素，鹿茸菇多糖提取率為考察指標，應用design-expert.v8.0.6.1軟件進行三因素三水平的響應面實驗分析，得到回歸模型，利用回歸模型預測鹿茸菇多糖提取的最佳工藝參數(shù)；

8、其中在上述步驟六中，在最佳工藝參數(shù)下進行驗證試驗，重復多次，測定多糖提取率，將驗證試驗結(jié)果與回歸模型預測值進行比較，確定回歸模型的準確性和可靠性。

9、優(yōu)選的，所述步驟一中，具體為：稱取粉碎的鹿茸菇10g，按液料比20ml/g加入蒸餾水200ml，充分混勻，調(diào)節(jié)ph值為5.5，加入3％木瓜蛋白酶，充分混勻，置于55℃水浴中反應3h，然后迅速升溫至100℃繼續(xù)反應30min滅酶，再85℃水浴3h，過濾，離心取上清液，濾渣按液料比20ml/g加蒸餾水，重復酶提一次，再85℃水浴3h，過濾，離心取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將離心歸并后的上清液濃縮至原始體積的約1/3，將95％的乙醇慢慢加入到濃縮后的上清液中至最后的酒精濃度為80％，4℃靜置過夜；離心得沉淀物，按質(zhì)量體積比1:5加蒸餾水溶解，靜置，離心得上清液，加入95％乙醇至最后的酒精濃度為80％，4℃靜置過夜，離心，除去乙醇，沉淀部分加入95％乙醇攪拌，離心去乙醇，置于-20℃冰箱12h以上，冷凍干燥得沉淀物鹿茸菇多糖。

10、優(yōu)選的，所述步驟二中，具體為：稱取10mg葡聚糖，置于100ml容量瓶中，制成0.1g/l葡聚糖儲備液，分別取標準葡聚糖儲備液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8ml置試管中，每管加水至總體積為1.0ml，各試管再加1.0ml6％苯酚試劑，混勻；加入5.0ml濃硫酸，靜置10min，混勻，室溫靜置20min，在吸收波長490nm處測定吸光度值，以吸光度為橫坐標，葡聚糖質(zhì)量為縱坐標，繪制標準曲線。

11、優(yōu)選的，所述步驟三中，具體為：取步驟一中制備的鹿茸菇多糖10mg，置于100ml容量瓶中，制成0.1g/l鹿茸菇多糖溶液，按照步驟二的操作，測定吸光度，采用如下公式計算鹿茸菇多糖提取率：

12、

13、式中：c為回歸曲線方程計算得到的鹿茸菇多糖的濃度，g/l；v為溶液體積，l；n為稀釋倍數(shù)；m為鹿茸菇的質(zhì)量，g。

14、優(yōu)選的，所述步驟四中，單因素實驗所改變的工藝參數(shù)包括酶解時間、酶解溫度、ph值、液料比和酶添加量。

15、優(yōu)選的，所述單因素實驗中，改變酶解時間具體為：在固定料液比為20ml/g、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解溫度為55℃、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將酶解時間分別設(shè)置為1.5h、2h、2.5h、3h和3.5h，研究酶解時間對鹿茸菇多糖提取率的影響。

16、優(yōu)選的，所述單因素實驗中，改變酶解溫度具體為：在固定料液比為20ml/g、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解時間為3h、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將酶解溫度分別設(shè)置為45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，研究酶解溫度對鹿茸菇多糖提取率的影響。

17、優(yōu)選的，所述單因素實驗中，改變ph值具體為：在固定料液比為20ml/g、酶解溫度為55℃、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解時間為3h條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將ph值分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，研究ph值對鹿茸菇多糖提取率的影響。

18、優(yōu)選的，所述單因素實驗中，改變液料比具體為：在酶解溫度為55℃、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解時間為3h、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將液料比分別調(diào)為10、15、20、25、30ml/g，研究液料比對鹿茸菇多糖得率的影響。

19、優(yōu)選的，所述單因素實驗中，改變酶添加量具體為：在固定料液比為20ml/g、酶解溫度為55℃、酶解時間為3h、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將木瓜蛋白酶濃度分別調(diào)為1％、2％、3％、4％和5％，研究木瓜蛋白酶濃度對鹿茸菇多糖提取率的影響。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用酶解水提法提取鹿茸菇多糖，提取率高且操作簡單，本發(fā)明通過單因素實驗考察酶解時間、酶解溫度、ph、酶添加量、液料比對鹿茸菇多糖提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上選取酶解時間、酶解溫度、ph三個因素，利用box-behnken響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，確定了提取鹿茸菇多糖的最佳工藝條件，因此本發(fā)明對鹿茸菇多糖的生產(chǎn)應用具有較高的參考價值。

技術(shù)特征：

1.響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，包括以下步驟：步驟一，確定鹿茸菇多糖提取方法；步驟二，標準曲線繪制；步驟三，鹿茸菇多糖提取率的測定；步驟四，單因素實驗；步驟五，響應面工藝優(yōu)化實驗；步驟六，最佳工藝條件驗證；其特征在于：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述步驟一中，具體為：稱取粉碎的鹿茸菇10g，按液料比20ml/g加入蒸餾水200ml，充分混勻，調(diào)節(jié)ph值為5.5，加入3％木瓜蛋白酶，充分混勻，置于55℃水浴中反應3h，然后迅速升溫至100℃繼續(xù)反應30min滅酶，再85℃水浴3h，過濾，離心取上清液，濾渣按液料比20ml/g加蒸餾水，重復酶提一次，再85℃水浴3h，過濾，離心取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將離心歸并后的上清液濃縮至原始體積的約1/3，將95％的乙醇慢慢加入到濃縮后的上清液中至最后的酒精濃度為80％，4℃靜置過夜；離心得沉淀物，按質(zhì)量體積比1:5加蒸餾水溶解，靜置，離心得上清液，加入95％乙醇至最后的酒精濃度為80％，4℃靜置過夜，離心，除去乙醇，沉淀部分加入95％乙醇攪拌，離心去乙醇，置于-20℃冰箱12h以上，冷凍干燥得沉淀物鹿茸菇多糖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述步驟二中，具體為：稱取10mg葡聚糖，置于100ml容量瓶中，制成0.1g/l葡聚糖儲備液，分別取標準葡聚糖儲備液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8ml置試管中，每管加水至總體積為1.0ml，各試管再加1.0ml6％苯酚試劑，混勻；加入5.0ml濃硫酸，靜置10min，混勻，室溫靜置20min，在吸收波長490nm處測定吸光度值，以吸光度為橫坐標，葡聚糖質(zhì)量為縱坐標，繪制標準曲線。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述步驟三中，具體為：取步驟一中制備的鹿茸菇多糖10mg，置于100ml容量瓶中，制成0.1g/l鹿茸菇多糖溶液，按照步驟二的操作，測定吸光度，采用如下公式計算鹿茸菇多糖提取率：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述步驟四中，單因素實驗所改變的工藝參數(shù)包括酶解時間、酶解溫度、ph值、液料比和酶添加量。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述單因素實驗中，改變酶解時間具體為：在固定料液比為20ml/g、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解溫度為55℃、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將酶解時間分別設(shè)置為1.5h、2h、2.5h、3h和3.5h，研究酶解時間對鹿茸菇多糖提取率的影響。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述單因素實驗中，改變酶解溫度具體為：在固定料液比為20ml/g、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解時間為3h、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將酶解溫度分別設(shè)置為45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，研究酶解溫度對鹿茸菇多糖提取率的影響。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述單因素實驗中，改變ph值具體為：在固定料液比為20ml/g、酶解溫度為55℃、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解時間為3h條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將ph值分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，研究ph值對鹿茸菇多糖提取率的影響。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述單因素實驗中，改變液料比具體為：在酶解溫度為55℃、木瓜蛋白酶濃度3％、酶解時間為3h、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將液料比分別調(diào)為10、15、20、25、30ml/g，研究液料比對鹿茸菇多糖得率的影響。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，其特征在于：所述單因素實驗中，改變酶添加量具體為：在固定料液比為20ml/g、酶解溫度為55℃、酶解時間為3h、ph值為5.5條件下，每組三個平行，分別加入10g鹿茸菇，將木瓜蛋白酶濃度分別調(diào)為1％、2％、3％、4％和5％，研究木瓜蛋白酶濃度對鹿茸菇多糖提取率的影響。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，包括以下步驟：步驟一，確定鹿茸菇多糖提取方法；步驟二，標準曲線繪制；步驟三，鹿茸菇多糖提取率的測定；步驟四，單因素實驗；步驟五，響應面工藝優(yōu)化實驗；步驟六，最佳工藝條件驗證；本發(fā)明采用酶解水提法提取鹿茸菇多糖，提取率高且操作簡單，本發(fā)明通過單因素實驗考察酶解時間、酶解溫度、pH、酶添加量、液料比對鹿茸菇多糖提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上選取酶解時間、酶解溫度、pH三個因素，利用Box?Behnken響應面法優(yōu)化鹿茸菇多糖的提取工藝，確定了提取鹿茸菇多糖的最佳工藝條件，因此本發(fā)明對鹿茸菇多糖的生產(chǎn)應用具有較高的參考價值。

技術(shù)研發(fā)人員：何穎,胡庭俊,陳忠偉,秦毅斌,趙碩,程珂,盧冰霞,段群棚,許心婷,陳婷婷,許藝蘭,楊訊業(yè),郭梓萱,關(guān)銘,余小麗,趙雯
受保護的技術(shù)使用者：廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19