本發(fā)明屬于生物制藥，具體涉及一種調(diào)控平滑肌收縮的aav載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、平滑肌收縮是由腸神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)在相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的綜合調(diào)控下激活鈣離子參與的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在atp供能下，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合，粗細(xì)肌絲之間發(fā)生肌絲滑行，從而實(shí)現(xiàn)平滑肌的收縮。平滑肌收縮障礙可能導(dǎo)致多種疾病，如胃食管反流病、腸易激綜合征、大便失禁、慢性便秘、胃輕癱、小便失禁等。引起平滑肌收縮障礙的主要原因有細(xì)胞功能異常、神經(jīng)功能障礙、電解質(zhì)紊亂、藥物影響等。目前，針對(duì)平滑肌細(xì)胞收縮功能的調(diào)控策略主要集中于信號(hào)通路的靶點(diǎn)，如鈣離子依賴的平滑肌收縮機(jī)制、rhoa/rock通路和pkc通路。然而，這些通路的調(diào)節(jié)不僅影響平滑肌的收縮，還易產(chǎn)生全身性作用，缺乏特異性。

2、細(xì)胞骨架是由多種結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白按照特定的模式有機(jī)組裝而形成的一種立體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，是保持特定細(xì)胞形態(tài)和形式收縮功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。其中由肌動(dòng)蛋白及其結(jié)合蛋白組成的微絲是平滑肌細(xì)胞(smc)中最主要的細(xì)胞骨架。細(xì)胞骨架相關(guān)基因包括平滑肌特異性肌球蛋白重鏈(smmhc，由myh11基因編碼)、平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(α-sma，由acta2基因編碼)、轉(zhuǎn)膠蛋白(sm22α，由tagln基因編碼)、鈣調(diào)蛋白(calponin，由基因cnn1編碼)和鈣調(diào)結(jié)合蛋白(caldesmon，由cald1基因編碼)。以α-sma為例，α-sma是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，主要位于細(xì)胞骨架的張力纖維上，通過與肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白的交聯(lián)，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的結(jié)合，從而引發(fā)平滑肌的收縮。因此，通過調(diào)控α-sma的表達(dá)可以調(diào)控細(xì)胞的收縮功能。

3、腺相關(guān)病毒(aav)是一種直徑約26納米的小病毒，因其低免疫原性、低基因整合能力、長期表達(dá)外源基因的能力以及對(duì)細(xì)胞類型特異性感染的能力而在基因治療領(lǐng)域受到青睞。aav具有高安全性和生物相容性，能夠有效地將治療基因傳遞到多種組織，包括眼睛、肝臟、大腦、內(nèi)耳、心肌和骨骼肌等。目前臨床使用的是重組型aav，它去除了大部分野生型aav基因，無法復(fù)制，具有極低的基因組整合率和免疫原性，從而確保了其安全性。aav有多種血清型，允許研究人員根據(jù)需要選擇特定的血清型以在體內(nèi)靶向不同的細(xì)胞群。重組aav基因治療藥物能夠在體內(nèi)長期穩(wěn)定地表達(dá)治療基因，實(shí)現(xiàn)一次性治療的長期甚至終身效果，使其成為治療遺傳病或退行性疾病的理想選擇。截至2024年8月，全球已有8款aav基因治療藥物獲批上市，數(shù)千項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，其中超過四分之一使用aav載體。有研究探討了aav在骨骼肌局部注射時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和不同血清型aav在不同肌肉組織中的轉(zhuǎn)染效率，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道局部注射靶向性調(diào)控平滑肌收縮功能的方法。

4、因此，本發(fā)明構(gòu)建了一種以aav為載體的靶向調(diào)控平滑肌收縮的基因例如acta2的基因治療藥物，通過局部注射，驗(yàn)證其對(duì)平滑肌細(xì)胞收縮力的影響，進(jìn)而探討其平滑肌收縮下降相關(guān)疾病例如胃食管反流病的治療效果，觀察其對(duì)下食管括約肌的影響以及對(duì)胃食管反流動(dòng)物模型的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控平滑肌收縮的aav載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種調(diào)控平滑肌收縮的aav載體，所述aav載體由在pssaav-cba-luc-p2a-gfp-bgh-141載體的多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)間插入調(diào)控平滑肌收縮的基因得到。

4、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述調(diào)控平滑肌收縮的基因?yàn)樵鰪?qiáng)平滑肌收縮功能的基因。

5、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述促進(jìn)平滑肌收縮力的基因?yàn)閍cta2基因，其得到的aav載體為pssaav-cba-acta2-p2a-gfp-bgh-141，所述pssaav-cba-acta2-p2a-gfp-bgh-141的序列如seq?id?no.7所示。

6、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述促進(jìn)平滑肌收縮力的基因?yàn)閏nn1基因，其得到的aav載體為pssaav-cba-cnn1-p2a-gfp-bgh-141，所述pssaav-cba-cnn1-p2a-gfp-bgh-141的序列如seq?id?no.8所示。

7、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述促進(jìn)平滑肌收縮力的基因?yàn)閠agln基因，其得到的aav載體為pssaav-cba-tagln-p2a-gfp-bgh-141，所述pssaav-cba-tagln-p2a-gfp-bgh-141的序列如seq?id?no.9所示。

8、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)為限制性內(nèi)切酶hindiii與kpn2i的酶切位點(diǎn)。

9、本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種如前所述的調(diào)控平滑肌收縮的aav載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

10、s1：將pssaav-cba-luc-p2a-gfp-bgh-141質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、瓊脂糖電泳后切膠回收，得到pssaav-cba-p2a-gfp-bgh-141載體片段；

11、s2：將調(diào)控平滑肌收縮的基因序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收后，得到調(diào)控平滑肌收縮的基因片段；

12、s3：將上述得到的pssaav-cba-p2a-gfp-bgh-141載體片段和調(diào)控平滑肌收縮的基因片段進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物；

13、s4：取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，然后涂布至含有氨芐青霉素的lb瓊脂平板，得到含有調(diào)控平滑肌收縮的基因的重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌；

14、s5：挑取單克隆菌落接種于含有氨芐青霉素液體lb中振蕩培養(yǎng)，篩選出陽性質(zhì)粒；

15、s6：將陽性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后，再進(jìn)行測序鑒定，獲得含有調(diào)控平滑肌收縮的基因的aav載體。

16、本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體包含如前所述的調(diào)控平滑肌收縮的aav載體。

17、本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如前所述的aav載體為活性成分；以及

18、藥學(xué)上可接受的載體或佐劑。

19、本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了一種如前所述的aav載體、轉(zhuǎn)化體或藥物組合物在制備通過調(diào)控平滑肌收縮治療相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，所述相關(guān)疾病包括胃食管反流病、大便失禁、慢性便秘、胃輕癱或小便失禁。

20、本發(fā)明的技術(shù)效果和優(yōu)點(diǎn)：

21、1、本發(fā)明構(gòu)建了一種插入有調(diào)控平滑肌收縮基因的aav重組載體，該重組載體可以靶向平滑肌細(xì)胞，降低了插入突變的概率，免疫原性低，具有較好的安全性和較高的特異性；還可增加外源基因存在的時(shí)間和表達(dá)時(shí)間，提供一次性治療效果的可能性。

22、2、動(dòng)物試驗(yàn)表明，本發(fā)明的aav重組載體可以通過調(diào)控與平滑肌收縮相關(guān)的基因例如acta2的表達(dá)直接增加平滑肌的收縮力。該結(jié)果提示該類重組aav載體在調(diào)控平滑肌收縮能力中發(fā)揮重要作用，具有較高的應(yīng)用潛能。有望成為臨床上治療與平滑肌收縮功能下降相關(guān)疾病的有效靶標(biāo)，為胃食管反流病、大便失禁、慢性便秘、胃輕癱、小便失禁等疾病的治療開發(fā)一種高效調(diào)控平滑肌收縮的藥物，提供新的研究方向。