本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域,特別涉及一種富含c-di-gmp的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解,而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
2、隨著免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域的成熟和臨床評(píng)估的趨勢(shì)越來(lái)越多,我們對(duì)腫瘤-免疫細(xì)胞相互作用復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深。雖然免疫療法已成為許多癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療,但仍有55-87%的患者對(duì)檢查點(diǎn)抑制劑無(wú)反應(yīng)。為提高反應(yīng)率,人們對(duì)開(kāi)發(fā)先天免疫激動(dòng)劑以驅(qū)動(dòng)腫瘤內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞(apc)活化和nk/t等效應(yīng)細(xì)胞激活的興趣日益濃厚,如干擾素基因刺激因子(sting)激動(dòng)劑。sting激活介導(dǎo)多方面的?i?型干擾素(ifn-i)反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)的成熟和遷移,并引發(fā)細(xì)胞毒性?t?淋巴細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞進(jìn)行自發(fā)免疫反應(yīng)。
3、環(huán)二核苷酸(cdn)是sting的天然高親和力配體,其主要包括細(xì)菌來(lái)源的環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-gmp)、環(huán)二腺苷酸(c-di-amp)、環(huán)二鳥(niǎo)苷腺苷酸(3,3-cgamp)以及人體來(lái)源的環(huán)二鳥(niǎo)苷腺苷酸(2,3-cgamp)。上述sting激動(dòng)劑在臨床的應(yīng)用還面臨多種問(wèn)題,例如cdn的系統(tǒng)給藥的脫靶效應(yīng)容易引發(fā)系統(tǒng)性免疫毒性;脫靶細(xì)胞t細(xì)胞中sting的激活,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并最終阻礙免疫記憶的形成。因此,有研究人員嘗試將cdn通過(guò)瘤內(nèi)給藥的方法減少這些非靶向的全身效應(yīng)并提高此類(lèi)方法的整體療效。然而,cdn負(fù)電荷的固有特性極大的限制了其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的效率。此外,cdn在體內(nèi)快速酶降解和清除進(jìn)一步阻礙了其臨床應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述cdn臨床應(yīng)用過(guò)程中所面臨的問(wèn)題,設(shè)計(jì)一種能夠選擇性靶向apc并保護(hù)cdn不被降解的遞送系統(tǒng)有望降低cdn的脫靶毒性、提高療效并推動(dòng)cdn的臨床應(yīng)用。現(xiàn)在的研究方向主要集中在開(kāi)發(fā)新型cdn的遞送載體,然后對(duì)cdn進(jìn)行包載得到有效的cdn遞送系統(tǒng);本發(fā)明以c-di-gmp為例,直接利用可產(chǎn)生c-di-gmp的細(xì)菌一體化制備包載c-di-gmp的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,該囊泡可將c-di-gmp有效遞送至apc并激活sting。此方法可實(shí)現(xiàn)載體和c-di-gmp的同步制備,相比于傳統(tǒng)方法更簡(jiǎn)便。
2、本發(fā)明一方面,提供一種細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡中含有環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-gmp)。
3、進(jìn)一步的,細(xì)菌質(zhì)膜囊泡中c-di-gmp含量大于等于39.9pg/mg。
4、進(jìn)一步的,細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。
5、進(jìn)一步的,細(xì)菌質(zhì)膜囊泡由革蘭氏陰性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌中獲得。
6、進(jìn)一步的,細(xì)菌質(zhì)膜囊泡在菌株通過(guò)誘導(dǎo)劑富含c-di-gmp后獲得。
7、進(jìn)一步的,誘導(dǎo)劑選自熊去氧膽酸、精氨酸、亞精胺中的一種或多種。
8、本發(fā)明另一方面,提供一種細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的制備方法,步驟如下:
9、(1)采用誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使細(xì)菌中富含c-di-gmp;
10、(2)采用溶菌酶降解外膜,獲得富含c-di-gmp的細(xì)菌原生質(zhì)體;
11、(3)微孔濾膜擠出,獲得富含c-di-gmp細(xì)菌質(zhì)膜囊泡。
12、進(jìn)一步的,步驟(1)中誘導(dǎo)采用的誘導(dǎo)劑選自熊去氧膽酸、精氨酸、亞精胺中的一種或多種。
13、進(jìn)一步的,步驟(3)粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。
14、進(jìn)一步的,一種細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的制備方法,詳細(xì)步驟如下:
15、(1)將10μl?od值為1的菌液(大腸桿菌或者鼠傷寒沙門(mén)氏菌)接種至5ml?lb液體培養(yǎng)基中并添加誘導(dǎo)劑(l-精氨酸、熊去氧膽酸、亞精胺其中的一種或多種)。將菌液于37℃,200rpm條件下培養(yǎng)12h。在這個(gè)過(guò)程中,誘導(dǎo)劑刺激細(xì)菌產(chǎn)生大量c-di-gmp聚集在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中。培養(yǎng)結(jié)束后,6000g離心5min收集細(xì)菌。
16、(2)將步驟(1)收集到的細(xì)菌,重懸至2?ml含有20%蔗糖、50mm?edta和2mg/ml溶菌酶的tris-hcl緩沖液(50mm,ph=8.0)中,并在37℃,100rpm條件下孵育30min。在這個(gè)過(guò)程中,溶菌酶降解具有毒性的細(xì)菌外膜。孵育結(jié)束后,6000g離心5min,棄去含有細(xì)菌外膜成分的上清液,收集細(xì)菌原生質(zhì)體沉淀。
17、(3)將步驟(2)所收集的細(xì)菌原生質(zhì)體用2ml生理鹽水重懸,隨后依次通過(guò)1μm、400nm和200nm孔徑的微孔濾膜,最終得到粒徑為50-300nm的富含c-di-gmp的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡。在過(guò)膜擠出的過(guò)程中,細(xì)菌質(zhì)膜被打破重排形成粒徑更小的囊泡,重排時(shí)將c-di-gmp包裹進(jìn)入囊泡。
18、本發(fā)明另一方面,提供一種細(xì)菌質(zhì)膜囊泡在制備激活sting通路藥物中的應(yīng)用。
19、本發(fā)明另一方面,提供一種細(xì)菌質(zhì)膜囊泡在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
20、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是:
21、(1)本發(fā)明通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)菌大量產(chǎn)生c-di-gmp,然后在制備細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的過(guò)程中,c-di-gmp被囊泡包載得到載c-di-gmp的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)囊泡和c-di-gmp的同步制備,制備過(guò)程更簡(jiǎn)單。
22、(2)該囊泡本身富含sting激動(dòng)劑c-di-gmp,具有激活靶細(xì)胞sting通路的功能,無(wú)需額外添加sting激動(dòng)劑。
23、(3)本發(fā)明在制備囊泡的過(guò)程中特意去除了具有毒性的細(xì)菌外膜,降低了毒性外膜成分誘導(dǎo)的全身炎癥水平,顯著提高了制劑的安全性。
24、(4)通過(guò)本發(fā)明制備的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡除了具有sting激活的能力外,細(xì)菌來(lái)源的質(zhì)膜囊泡還具有激活tlr的能力,與c-di-gmp協(xié)同激活apc,顯著提高了c-di-gmp的apc活化能力和最終的抗腫瘤效果。
25、(5)本發(fā)明利用細(xì)菌來(lái)源的質(zhì)膜囊泡作為c-di-gmp遞送的載體,可主動(dòng)靶向apc,降低脫靶毒性并提高安全性。
26、(6)本發(fā)明通過(guò)添加低成本的單一組分就能獲得大量具有sting激活能力的制劑,相較于傳統(tǒng)的sting激動(dòng)劑的獲得顯著降低了成本。
1.一種細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,其特征是,所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡中含有環(huán)二鳥(niǎo)苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,其特征是,所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡中環(huán)二鳥(niǎo)苷酸含量大于等于39.9pg/mg。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,其特征是,所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,其特征是,所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡由革蘭氏陰性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌中獲得。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡,其特征是,所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡在菌株通過(guò)誘導(dǎo)劑富含環(huán)環(huán)二鳥(niǎo)苷酸后獲得。
6.如權(quán)利要求1所述細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的制備方法,其特征是,步驟如下:
7.如權(quán)利要求6所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的制備方法,其特征是,步驟(1)中誘導(dǎo)采用的誘導(dǎo)劑選自熊去氧膽酸、精氨酸、亞精胺中的一種或多種。
8.如權(quán)利要求6所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡的制備方法,其特征是,步驟(3)粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。
9.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡在制備激活sting通路藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌質(zhì)膜囊泡在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。