本發(fā)明涉及引物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、手足口病(hand-foot-mouth?disease,hfmd)是由多種腸道病毒(enterovirus,ev)感染引起的常見(jiàn)傳染病，主要病原包括柯薩奇病毒a組(coxsackievirus?a,ca)4—7、9、10、16型和b組1—3、5型，?？刹《镜牟糠盅逍秃蚭v71等。手足口病多發(fā)于0-5歲嬰幼兒，典型表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、臀、口腔等部位的斑丘疹、皰疹，目前cva6已超過(guò)ev71和cva16成為hfmd的主要病原體，柯薩奇病毒a6引起的手足口病，該型皮損更廣泛、更嚴(yán)重，水皰大皰性皮損可累及手背、足背、小腿、前臂、軀干及頸部、口周，嚴(yán)重癥狀導(dǎo)致可能危及生命的腦炎及肺出血等并發(fā)癥。

2、cva6屬小核糖核酸病毒科腸道病毒屬a組，呈二十面體球型，無(wú)包膜，為單股正鏈rna，基因組全長(zhǎng)約7?400bp，包含1個(gè)開(kāi)放閱讀框及5′和3′非編碼區(qū)。cva6具有ev的一般理化特性，耐低溫耐酸，但可在高于56℃的溫度下失去活性，對(duì)干燥、紫外線(xiàn)和氧化劑較敏感。cva6毒株可分為6種基因型，分別為a至f，d基因型可進(jìn)一步細(xì)分為d1-3亞型。

3、目前針對(duì)于cva6的研究和鑒定主要有以下幾種方法：1.傳統(tǒng)血清學(xué)方法：采集患者血液樣本，分離血清后使用特異性抗原進(jìn)行檢測(cè)，然而這種方法耗時(shí)久，且病毒分離有失敗的可能，靈敏度不夠；2.常規(guī)定量pcr方法：根據(jù)cva6核酸序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，在特定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，通過(guò)擴(kuò)增特異性目的片段對(duì)cva6的存在和豐度進(jìn)行鑒定，然而定量pcr只能鑒定存在柯薩奇cva6病毒存在，無(wú)法進(jìn)行更進(jìn)一步的基因序列分析和分型；3.測(cè)序方法：目前針對(duì)于柯薩奇病毒的測(cè)序研究較多的是vp1基因，通過(guò)設(shè)計(jì)引物對(duì)vp1基因進(jìn)行靶向擴(kuò)增和測(cè)序，對(duì)得到的序列進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)等分析。比如cn107513584b提供的一種檢測(cè)腸道病毒的五毒熒光定量試劑盒，也僅是能夠鑒定cva6病毒但無(wú)法進(jìn)行全基因組研究和分型鑒定。

4、綜上所述，目前市面上暫無(wú)針對(duì)于柯薩奇a6的全基因組的研究，導(dǎo)致無(wú)法很好地理解病毒的遺傳變異、進(jìn)化關(guān)系，以及無(wú)法很好地針對(duì)該病毒進(jìn)行有效防控措施。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合、試劑盒及應(yīng)用，針對(duì)柯薩奇a6亞型的全基因組按照疊瓦式原理設(shè)計(jì)了7對(duì)引物的引物池，利用引物池實(shí)現(xiàn)cva6亞型全基因組產(chǎn)物的反轉(zhuǎn)錄與富集擴(kuò)增。

2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本技術(shù)方案提供了一種柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合，包括：

3、第一引物池，其中第一引物池包括序列如seq?id?no.1-seq?id?no.3的第一引物對(duì)、序列如seq?id?no.6-seq?id?no.7的第三引物對(duì)、序列如seq?id?no.10-seq?id?no.11的第五引物對(duì)、序列如seq?id?no.14-seq?id?no.16的第七引物對(duì)；

4、第二引物池，其中所述第二引物池包括序列如seq?id?no.4-seq?id?no.5的第二引物對(duì)、序列如seq?id?no.8-seq?id?no.9的第四引物對(duì)、序列如seq?id?no.12-seq?idno.13的第六引物對(duì)；

5、第一引物池和第二引物池內(nèi)的引物對(duì)的引物序列依次交叉重疊。

6、本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合針對(duì)cva6亞型的全基因組按照疊瓦式原理設(shè)計(jì)了7對(duì)引物對(duì)，相鄰引物對(duì)之間存在重疊的重疊序列，進(jìn)而避免了在擴(kuò)增過(guò)程中缺失全基因組中的部分片段。不僅如此，本方案將7對(duì)引物對(duì)中相鄰的具有重疊序列的引物對(duì)分為兩個(gè)引物池，利用兩個(gè)引物池對(duì)cva6亞型進(jìn)行全基因組分段擴(kuò)增，避免優(yōu)先擴(kuò)增相對(duì)較短的重疊序列，最后把擴(kuò)增產(chǎn)物混合就得到了cva6亞型全基因組產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)cva6亞型全基因組反轉(zhuǎn)錄與富集擴(kuò)增，最終得到的dna產(chǎn)物可用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括二代和三代全基因組測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

7、在一些實(shí)施例中，第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)、第四引物對(duì)、第五引物對(duì)、第六引物對(duì)和第七引物對(duì)通過(guò)疊瓦式pcr原理設(shè)計(jì)得到。本方案的第一引物池和第二引物池內(nèi)的引物對(duì)的引物序列依次交叉重疊指的是：第二引物池內(nèi)的偶數(shù)值對(duì)應(yīng)的引物對(duì)同第一引物池內(nèi)的相鄰的奇數(shù)值對(duì)應(yīng)的引物對(duì)具有重疊序列。

8、具體的：

9、第二引物池內(nèi)的第二引物對(duì)同第一引物池的第一引物對(duì)以及第三引物對(duì)分別具有重疊序列；

10、第二引物池內(nèi)的第四引物對(duì)同第一引物池的第三引物對(duì)以及第五引物對(duì)分別具有重疊序列；

11、第二引物池內(nèi)的第六引物對(duì)同第一引物池內(nèi)的第五引物對(duì)以及第七引物對(duì)分別具有重疊序列。

12、另外，第一引物池內(nèi)的不同引物對(duì)彼此之間不具有重疊序列，第二引物池內(nèi)的不同引物對(duì)之間也不具有重疊序列。

13、在一些實(shí)施例中，第一引物對(duì)包括seq?id?no.1所示的左引物、seq?id?no.2的左引物和seq?id?no.3所示的右引物，第二引物對(duì)包括seq?id?no.4所示的左引物和seq?idno.5所示的右引物，第三引物對(duì)包括seq?id?no.6所示的左引物和seq?id?no.7所示的右引物，第四引物對(duì)包括seq?id?no.8所示的左引物和seq?id?no.9所示的右引物，第五引物對(duì)包括seq?id?no.10所示的左引物和seq?id?no.11所示的右引物，第六引物對(duì)包括seq?idno.12所示的左引物和seq?id?no.13所示的右引物，第七引物對(duì)包括seq?id?no.14所示的左引物、seq?id?no.15所示的右引物和seq?id?no.16所示的右引物。同一引物對(duì)內(nèi)的左引物將結(jié)合到目標(biāo)dna的正鏈上，并從5'端向3'端延伸，相對(duì)的右引物將結(jié)合到結(jié)合到目標(biāo)dna的負(fù)鏈上，并同樣從5'端向3'端延伸，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)特異性地?cái)U(kuò)增復(fù)制。關(guān)于第一引物池和第二引物池的引物序列如表一所示：

14、表一引物序列表

15、

16、

17、

18、在一些實(shí)施例中，第一引物池和第二引物池內(nèi)的每一引物對(duì)的擴(kuò)增片段在1024-1200bp，優(yōu)選在1200bp的長(zhǎng)度，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的高效性與保真性；且每一引物對(duì)選擇在保守性較高的區(qū)域。

19、具體的，第一引物對(duì)覆蓋1-1294bp的位置，第二引物對(duì)覆蓋1102-2381bp的位置，第三引物對(duì)覆蓋2159-3330bp的位置，第四引物對(duì)覆蓋3190-4469bp的位置，第五引物對(duì)覆蓋4218-5505bp的位置，第六引物對(duì)覆蓋5369-6572bp的位置，第七引物對(duì)覆蓋6390-7414bp的位置。

20、在一些實(shí)施例中，同時(shí)在第一引物對(duì)中添加了一條正向引物，第七引物對(duì)中添加了一條反向引物。這樣做的好處在于有很多病毒的參考基因組的首尾是不全的，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候只有很少的序列可以參考，引物設(shè)計(jì)容易出現(xiàn)脫靶，因此在首尾位置多增加一條額外的引物來(lái)確保擴(kuò)增效果。

21、第二方面，本方案提供了一種柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒，包括：第一方面提到的柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合以及反轉(zhuǎn)錄試劑。

22、本方案利用柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒中提到的高熱穩(wěn)定性、高效的反轉(zhuǎn)錄酶可從純化的總dna中一致且快速地合成cdna，利用本方案提供的引物組合可擴(kuò)增得到柯薩奇a6全基因組，本方案得到柯薩奇a6全基因組可用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括二代和三代全基因組測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

23、在一些實(shí)施例中，本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒可用于擴(kuò)增柯薩奇a6全基因組產(chǎn)物，且柯薩奇a6全基因組產(chǎn)物可用于二代和三代全基因組測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

24、在一些實(shí)施例中，本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲試劑盒面向于鼻咽拭子、肛拭子、皰疹液環(huán)境中提取的核酸樣本進(jìn)行柯薩奇a6全基因組產(chǎn)物的捕獲。

25、第三方面，本方案提供了一種柯薩奇a6的全基因組捕獲的非診斷方法，包括：

26、獲取待測(cè)核酸樣本；

27、利用反轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)待測(cè)核酸樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cdna鏈；

28、對(duì)cdna鏈用第一引物池進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；

29、對(duì)cdna鏈用第二引物池進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物；

30、合并第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物得到柯薩奇a6全基因組。

31、在“利用反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)待測(cè)核酸樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cdna鏈”步驟中，按照如下表二所示的反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cdna鏈，

32、表二反轉(zhuǎn)錄程序表

33、 步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán) 1 25℃ 10分鐘 1 2 50℃ 10分鐘 1 3 85℃ 5分鐘 1 4 4℃ 保持 ?

34、。

35、在一些實(shí)施例中，選用rt?super?mix作為反轉(zhuǎn)錄試劑，rt?super?mix是一種用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的預(yù)混試劑，通常包含所有必需的成分以進(jìn)行高效的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，包括反轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、dntps、緩沖液、rnase抑制劑和其他輔助因子。

36、在“對(duì)cdna鏈用第一引物池進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)cdna鏈用第二引物池進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物”步驟中，多重pcr擴(kuò)增的條件相同，多重pcr擴(kuò)增條件為：循環(huán)1：在98℃進(jìn)行30秒；循環(huán)2：在98℃進(jìn)行15秒并在63℃下進(jìn)行5分鐘；循環(huán)3：在98℃進(jìn)行15秒并在65℃下進(jìn)行4分鐘；循環(huán)4：在72℃進(jìn)行2分鐘；循環(huán)5：在4℃保持，其中循環(huán)2進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，循環(huán)3進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。

37、本方案提供的多重pcr擴(kuò)增的pcr程序表如表三所示：

38、表三pcr程序表

39、

40、

41、

42、在一些實(shí)施例中，對(duì)柯薩奇a6全基因組進(jìn)行測(cè)序，選擇為二代測(cè)序平臺(tái)或者三代測(cè)序平臺(tái)。

43、相較現(xiàn)有技術(shù)，本技術(shù)方案具有以下特點(diǎn)和有益效果：

44、本方案通過(guò)疊瓦式pcr原理設(shè)計(jì)了具有重疊的序列部分的7對(duì)引物，且將7對(duì)引物分成兩個(gè)引物池分別進(jìn)行分段擴(kuò)增，每段擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約1200bp，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的高效性與保真性，最后把擴(kuò)增產(chǎn)物混合就得到了cva6亞型全基因組產(chǎn)物。具體的，本方案利用疊瓦式pcr設(shè)計(jì)的7對(duì)相互重疊的引物，以確?？梢詳U(kuò)增得到cva6亞型全基因組的全長(zhǎng)序列，進(jìn)而可以準(zhǔn)確地對(duì)cva6所有變異株進(jìn)行分型，針對(duì)不同的變異設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并堿基去覆蓋，確保能成功擴(kuò)增大部分cva6毒株，另外本方案設(shè)計(jì)的7對(duì)引物相較于cva6亞型基因組而言具有擴(kuò)增長(zhǎng)度適宜且穩(wěn)定性較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，每對(duì)引物選擇在保守性最高的區(qū)域，同時(shí)在第一對(duì)引物中添加了一條正向引物，最后一對(duì)引物中添加了一條反向引物，保證對(duì)不同變異樣本的擴(kuò)增靈敏度和效率；同時(shí)考慮到若將7對(duì)引物一起進(jìn)行擴(kuò)增可能會(huì)導(dǎo)致引物擴(kuò)增比較短的重疊區(qū)域的問(wèn)題，本方案將7對(duì)引物分成兩個(gè)引物池進(jìn)行分段擴(kuò)增。

45、本方案提供的柯薩奇a6的全基因組捕獲引物組合、試劑盒及應(yīng)用具有兼容性好：可實(shí)現(xiàn)cva6所有變異株和分型的全基因組擴(kuò)增；覆蓋度高：擴(kuò)增得到的序列能覆蓋cva699％以上的完整序列，覆蓋度均一；適配性好的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)。