本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物育種，具體涉及基于smyd3基因編輯技術(shù)創(chuàng)制抗病草魚的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、草魚是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水養(yǎng)殖魚類，被稱為“養(yǎng)活了半個中國”的魚類，其在改善民生膳食結(jié)構(gòu)、提供蛋白源等方面具有重要貢獻(xiàn)。據(jù)2024年《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，2023年我國草魚總產(chǎn)量達(dá)約594.13萬噸，約占淡水魚總產(chǎn)量17.4％。然而，隨著草魚養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模擴(kuò)大和產(chǎn)量上升，病毒病已成為草魚健康養(yǎng)殖的主要瓶頸之一。

2、草魚出血病(hemorrhagic?disease)是一種高傳染性、高致死性的病毒性疾病，已被中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為二類動物疫病，其病原為草魚呼腸孤病毒(grass?carp?reovirus，gcrv)。gcrv是我國分離鑒定的第一株魚類病毒，其為20面體球形顆粒，含有11個片段的雙鏈rna，根據(jù)基因組信息及生物學(xué)特性被分為gcrv-i、gcrv-ii和gcrv-iii型。其中，gcrv-ii型是近年來流行最廣、危害最大gcrv類型，是我國最主要的流行毒株。草魚出血病頻發(fā)于1齡草魚中，具有發(fā)病急、傳染快、致死率高等特點(diǎn)，每年對我國草魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，由于對gcrv-ii感染機(jī)制尚不清晰，目前還沒有針對gcrv-ii高效的防控手段。因此，利用現(xiàn)代化技術(shù)手段創(chuàng)制抗病草魚新種質(zhì)，將從根源上增強(qiáng)魚體抗病能力，減少經(jīng)濟(jì)損失，具有重要應(yīng)用價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于smyd3基因編輯技術(shù)創(chuàng)制抗草魚呼腸孤病毒ii型(gcrv-ii)感染的草魚新種質(zhì)的方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種抗病草魚的創(chuàng)制方法，包括靶向敲除草魚的smyd3基因，使得smyd3基因無法編碼蛋白或編碼的蛋白不再行使原始功能。優(yōu)選地，利用crispr/cas9編輯技術(shù)敲除草魚的smyd3基因，靶位點(diǎn)序列為5’-gcagaatgcatacgggtcgc-3’，將cas9蛋白和靶向smyd3基因的grna混勻后顯微注射到草魚i細(xì)胞期的受精卵中，通過基因型檢測篩選smyd3基因敲除的f0代嵌合體。

4、由上述方法構(gòu)建的smyd3基因敲除的f0代嵌合體具有抗草魚呼腸孤病毒ii型(gcrv-ii)感染的效果。對smyd3基因敲除的f0代嵌合體進(jìn)行g(shù)crv-ii病毒的攻毒實(shí)驗(yàn)，通過表型觀察與死亡時間記錄，發(fā)現(xiàn)smyd3敲除嵌合體相比于野生型具有較少的出血病征以及較高的存活率；通過檢測草魚組織中抗病毒基因(ifn1，isg15，mx2)和病毒基因(vp35，vp56)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)smyd3敲除嵌合體體內(nèi)抗病毒基因表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，gcrv-ii病毒的復(fù)制水平受到顯著抑制。因此，草魚smyd3敲除嵌合體抗gcrv-ii能力顯著增強(qiáng)，是一個理想的抗病毒感染的草魚新種質(zhì)。

5、本發(fā)明首次對草魚smyd3基因進(jìn)行基因編輯操作并獲得有敲除效果的f0代嵌合體，smyd3敲除嵌合體草魚具有較強(qiáng)的抗草魚呼腸孤病毒ii型(gcrv-ii)感染的能力，為草魚抗病毒感染的遺傳改良提供了方法，具有重要的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種抗病草魚的創(chuàng)制方法，其特征在于，包括靶向敲除草魚的smyd3基因，使得smyd3基因無法編碼蛋白或編碼的蛋白不再行使原始功能。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用crispr/cas9編輯技術(shù)敲除草魚的smyd3基因，靶位點(diǎn)序列為5’-gcagaatgcatacgggtcgc-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將cas9?蛋白和靶向smyd3基因的grna混勻后顯微注射到草魚i細(xì)胞期的受精卵中，通過基因型檢測篩選smyd3基因敲除的f0代嵌合體。

4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法在制備抗草魚呼腸孤病毒ii型感染的草魚中的應(yīng)用。

5.構(gòu)建抗草魚呼腸孤病毒ii型感染的草魚的試劑，其特征在于，包括cas蛋白和靶向smyd3基因的特異性grna。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，所述grna的靶向序列為5’-gcagaatgcatacgggtcgc-3’。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物育種技術(shù)領(lǐng)域，公開了基于smyd3基因編輯技術(shù)創(chuàng)制抗草魚出血病病毒（草魚呼腸孤病毒II型GCRV?II）感染的草魚新種質(zhì)的方法及應(yīng)用。以smyd3基因?yàn)榘谢驅(qū)σ吧筒蒴~進(jìn)行基因編輯，挑選smyd3基因敲除的F0代嵌合體進(jìn)行GCRV?II的攻毒實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)草魚smyd3敲除嵌合體具有較強(qiáng)的抗GCRV?II病毒感染的能力，為草魚等經(jīng)濟(jì)魚類抗病毒感染的遺傳改良提供了方法，具有重要的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：劉興,肖武漢,王子旋,劉穩(wěn)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院水生生物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19