本發(fā)明涉朗德鵝骨泥鮮味肽的分離純化及，具體為一種朗德鵝骨泥鮮味肽的分離純化工藝及鮮味肽篩選工藝。

背景技術(shù)：

1、朗德鵝最早產(chǎn)于法國(guó)西部朗德省，靠近比斯開(kāi)灣。在中國(guó)主要分布在山東、吉林、浙江、河北、山西、廣東、廣西和安徽等10多個(gè)省(直轄市、自治區(qū))。朗德鵝是世界著名的肥肝專用品種，其肉質(zhì)鮮美，具有低脂肪，低膽固醇的特點(diǎn)。鵝肝具有風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、口感細(xì)膩等特點(diǎn)。在飼養(yǎng)上，朗德鵝的培育重點(diǎn)在于雛鵝的培育，其中包括雛鵝的保溫、雛鵝的孵化方法、雛鵝的開(kāi)食等。初孵的雛鵝，由于其消化能力較弱，應(yīng)采用高蛋白、易食性、全價(jià)飼料。鵝作為食草水禽，在牧草資源豐富的地區(qū)，可以飼喂20％至40％的青飼料，在飼喂青飼料時(shí)，需要注意將其切碎并與精料混勻。朗德鵝的研究主要集中在飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)需求和生長(zhǎng)性能等方面。未來(lái)，朗德鵝的研究可以進(jìn)一步關(guān)注其品種改良、疾病防治和生態(tài)養(yǎng)殖等方面，以促進(jìn)朗德鵝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

2、鮮味肽作為一種新的呈鮮物質(zhì)，在食品科學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。主要來(lái)源于動(dòng)植物，鮮味肽不僅具有柔和的口感，還具有良好的功能性和加工特性。這與現(xiàn)代人對(duì)食品“天然、營(yíng)養(yǎng)、安全”的追求不謀而合，使得鮮味肽成為食品鮮味研究的重要方向。鮮味肽的柔和口感源于其分子結(jié)構(gòu)與味蕾的相互作用方式，這使得它在提供鮮味的同時(shí)，不會(huì)過(guò)于強(qiáng)烈或刺激。其功能特性包括增強(qiáng)食品風(fēng)味、提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。鮮味劑是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種天然增味劑，不但能使食物味道鮮美，增加其鮮度和醇度，還能與其它配料一起起到增效作用。鮮味肽因其較高的營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味活性，已成為當(dāng)前食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。鮮味肽具有減弱或掩蓋苦味，改善食品風(fēng)味的特性。這主要是由于鮮味肽能與苦味成分產(chǎn)生增效作用，從而減少味覺(jué)上的苦味，使食物的整體風(fēng)味更為醇厚、柔軟；鮮味肽具有良好的熱穩(wěn)定性，這意味著在食品加工過(guò)程中，它能夠承受熱處理而不會(huì)失去其風(fēng)味特性。這對(duì)于食品工業(yè)來(lái)說(shuō)是一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵S多食物加工時(shí)需加熱，如烹飪、罐裝或熱殺菌等。

3、現(xiàn)有技術(shù)缺乏對(duì)朗德鵝骨泥的鮮味肽的分離提純和篩選的工藝，為此，我們提出一種朗德鵝骨泥鮮味肽的分離純化工藝及鮮味肽篩選工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種朗德鵝骨泥鮮味肽的分離純化工藝及鮮味肽篩選工藝，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種朗德鵝骨泥鮮味肽的分離純化工藝，其特征在于，包括以下步驟：

3、s11、制備鵝骨泥水解液，取上清液備用；

4、s12、對(duì)鵝骨泥水解液的上清液進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)；

5、s13、通過(guò)電子舌對(duì)分離后的鵝骨泥進(jìn)行感官評(píng)定。

6、優(yōu)選的，s12中的分離實(shí)驗(yàn)包括納濾分離實(shí)驗(yàn)，所述納濾分離實(shí)驗(yàn)包括以下步驟：

7、s21、選用納濾膜是200da的過(guò)濾膜對(duì)水解液進(jìn)行納濾，除去溶液中的游離氨基酸和鹽；

8、s22、調(diào)節(jié)溶液ph值調(diào)到5-9，溶液總濃度為0.1％-1％，溶液溫度為5-45℃；

9、s23、連接儀器，分三次抽濾，把過(guò)濾出的多肽溶液濾液進(jìn)行甲醛電位滴定，判斷里面氨基酸含量，以此判定多肽溶液納濾效果；

10、s24、把多肽溶液濾液進(jìn)行超濾后冷凍干燥。

11、優(yōu)選的，s12中的分離實(shí)驗(yàn)包括超濾分離實(shí)驗(yàn)，所述超濾分離實(shí)驗(yàn)包括以下步驟：

12、s31、采用0.45μm有機(jī)濾膜對(duì)其進(jìn)行預(yù)過(guò)濾；

13、s32、采用截留分子量3000da以下的超濾膜對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾；

14、s33、采用uf離心管，溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為6000r/min，離心15min后，濾液冷凍干燥，-80℃保存。

15、優(yōu)選的，s12中的分離實(shí)驗(yàn)包括凝膠層析分離實(shí)驗(yàn)，所述凝膠層析分離實(shí)驗(yàn)包括以下步驟：

16、s41、在純水中溶解分子量低于3000da的鵝骨泥水解液，并于25℃裝入sephadexg-15色譜柱進(jìn)行分離；

17、s42、在色譜條件為5ml，100mg/ml、以1.0ml/min的流速用超純水進(jìn)行洗脫，并在220nm紫外光下進(jìn)行檢測(cè)；

18、s43、將各成分按譜峰順序收集、濃縮、凍干。

19、優(yōu)選的，由凝膠層析分離實(shí)驗(yàn)中分離出的成分在純水中溶解后，用0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，并利用反相高效液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行純化工藝，該純化工藝的步驟為：

20、s51、樣品體積為100μl，進(jìn)樣濃度為10mg/ml，采用c18柱，柱溫30℃；

21、s52、在所述樣品中，流動(dòng)相為0.05％三氟乙酸-乙腈，流動(dòng)相b為0.05％三氟乙酸-超純水，va:vb＝2:8，在流速為1ml/min的情況下，進(jìn)行40min的等梯度洗脫；

22、s53、用波長(zhǎng)為220nm紫外分光光度儀測(cè)定，按譜峰順序采集各成分，冷凍干燥。

23、優(yōu)選的，所述電子舌是由七個(gè)味道傳感器組成的味道探測(cè)系統(tǒng)，七個(gè)味道傳感器分別為酸味、咸味、nms、甜味、苦味、pks及cps感官風(fēng)味傳感器。

24、優(yōu)選的，所述電子舌的測(cè)定方式為：將10mg的骨泥水解液凍干粉溶解于70ml的純水中進(jìn)行電子舌測(cè)定，溶解濃度為0.14mg/ml。

25、一種朗德鵝骨泥鮮味肽的篩選工藝，該工藝包括以下步驟：

26、s61、通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)鵝骨泥水解液進(jìn)行肽組學(xué)分析；

27、s62、將液質(zhì)分析之后的氨基酸序列經(jīng)peaksonline軟件解析出的所有多肽序列，使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)peptideranker預(yù)測(cè)多肽的生物活性；

28、s63、篩選方式為：首先氨基酸序列中要有鮮味的氨基酸，然后不含有可能產(chǎn)生毒肽的氨基酸，再次發(fā)現(xiàn)的鮮味肽多為少于10個(gè)氨基酸的肽，最后在多肽置信度alc大于90％的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選。

29、優(yōu)選的，通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)鵝骨泥水解液進(jìn)行肽組學(xué)分析的步驟為：

30、s71、前處理樣品：

31、將骨泥鵝骨泥水解液凍干后的樣品在二次蒸餾水中溶解，然后在56℃下，加入dtt1小時(shí)，在避光室內(nèi)放置40min以去除過(guò)量dtt，以脫鹽柱為基礎(chǔ)，以1.5ml離心管為模板，將其洗脫至分離純化的肽段，45℃下，在真空離心濃縮機(jī)中去除過(guò)量的反應(yīng)物；

32、s72、毛細(xì)管液相層析條件：

33、a.柱子信息：預(yù)柱：300μm×5mm，acclaimpepmaprplcc18,5μm,色譜柱：150μm×150mm，acclaimpepmaprplcc18,1.9μm,

34、b.流動(dòng)相信息：

35、以0.1％的甲酸水為流動(dòng)相a，以0.1％甲酸和80％乙腈為流動(dòng)相b；梯度洗脫90min，條件為0～10min6％～9％b，10～30min9％～14％b,30～70min14％～30％b，70～87min30％～40％b，87～90min40％～95％b，流速600nl/min；

36、s73、質(zhì)譜檢測(cè)：

37、在樣品溶液中溶解多肽片段，在13200r/min的4℃下離心20min，將上清液直接輸入到質(zhì)譜進(jìn)行在線分析，具體參數(shù)如下：第一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如下分辨力：70000；agctarget:3e6；maximumitzz:40ms；第二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：17500；agctarget:1e5；maximumitzz:60ms；topn:20；采用人工denovo法對(duì)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二次denovo測(cè)序。

38、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

39、本發(fā)明采用nf、uf、gfc、rp-hplc和納升液相色譜-超高分辨四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)骨泥水解液為研究對(duì)象，進(jìn)行了分離純化和肽組學(xué)分析。又結(jié)合電子舌檢測(cè)對(duì)優(yōu)化后的骨泥水解液進(jìn)行鮮味強(qiáng)度的評(píng)價(jià)，再經(jīng)過(guò)肽組學(xué)分析，利用計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)對(duì)鮮味肽進(jìn)行篩選，通過(guò)本技術(shù)的研究，為朗德鵝骨泥的鮮味肽的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。