本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，具體涉及一種用于嚙齒動(dòng)物支原體檢測的通用pcr引物組和方法。

背景技術(shù)：

1、支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的最小原核細(xì)胞型微生物，它結(jié)構(gòu)簡單，大小介于病毒和細(xì)菌之間。支原體的細(xì)胞膜中含甾醇，因此可保持細(xì)胞膜的完整性。革蘭氏染色不易著色，支原體的種種特性都足以說明它不易被檢測和清除的特點(diǎn)。

2、支原體是spf級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須檢測的項(xiàng)目。環(huán)境中常見的病原體，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)僅能寄生生活。支原體感染嚙齒動(dòng)物時(shí)常表現(xiàn)出亞臨床癥狀，干擾其他研究，檢測相對(duì)困難，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究及研究人員帶來極大的危害。易感嚙齒動(dòng)物并產(chǎn)生病原學(xué)意義的主要有五種分型：肺支原體(mycoplasma?pulmonis)、關(guān)節(jié)炎支原體(mycoplasmaarthritidis)、溶神經(jīng)支原體(mycoplasma?neurolytica)、鼠支原體(mycoplasma?muris)和希爾氏支原體(mycoplasma?collis)。肺支原體感染小鼠嚴(yán)重時(shí)可在肺部出現(xiàn)病理損傷和呼吸道感染的典型癥狀。關(guān)節(jié)炎支原體感染小鼠可引起關(guān)節(jié)炎、中毒性休克和壞死性筋膜炎。溶神經(jīng)支原體感染動(dòng)物體后易使動(dòng)物產(chǎn)生許多神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。鼠支原體和希爾氏支原體比較少見，感染后分別對(duì)雌性小鼠生殖功能和結(jié)膜造成損傷。

3、支原體的檢測方法主要有：分離培養(yǎng)法、熒光染色法、核酸雜交技術(shù)、間接突光試驗(yàn)等多種方法。目前嚙齒動(dòng)物支原體檢測方法主要存在以下困難：分離培養(yǎng)法所需時(shí)間長，至少3周，且對(duì)培養(yǎng)技術(shù)要求較高；血清學(xué)檢測試劑成本高且僅能檢測肺支原體；目前國內(nèi)的支原體聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)仍是以肺支原體及其他對(duì)疫苗有重要影響的支原體分型為主，對(duì)于可嚴(yán)重影響嚙齒動(dòng)物的其余四種分型少有研究。所以尋找一種特異性好，靈敏度高，快速高效的嚙齒動(dòng)物易感支原體通用檢測方法十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測的通用pcr引物組和方法。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測的通用pcr引物組合，該引物組合為靶標(biāo)上游引物和下游引物，該靶標(biāo)上游引物的核苷酸序列是seq?id?no.1：atagagatatagtggaggttaa；該靶標(biāo)下游引物的核苷酸序列是seq?id?no.2：cccagtcaccagtcct。

3、本發(fā)明提供該引物組合在檢測嚙齒動(dòng)物易感支原體方面的應(yīng)用，或在制備嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測試劑盒方面的應(yīng)用。

4、本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包括該引物組合。

5、在一種實(shí)施方式中，該試劑盒還包括dna聚合酶和dntp。

6、本發(fā)明還提供該試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒用于檢測嚙齒動(dòng)物易感支原體，該支原體包括肺支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、溶神經(jīng)支原體、鼠支原體和希爾氏支原體。

7、本發(fā)明還提供了肺支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、溶神經(jīng)支原體、鼠支原體和希爾氏支原體的通用pcr檢測方法，包括以下步驟：

8、取待測樣品作為反應(yīng)模板，在包括該引物組合的反應(yīng)體系中進(jìn)行pcr擴(kuò)增；取pcr產(chǎn)物使用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

9、優(yōu)選地，該pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：dna聚合酶15μl；2.5mm?dntp?2μl；25μm的靶標(biāo)上下游引物各0.25μl；樣品dna?1.5μl；超純水補(bǔ)至30μl。

10、該pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，5min；95℃，30s，49℃～58℃，30s，72℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。

11、凝膠成像步驟為：取pcr產(chǎn)物7.5μl，用2％瓊脂糖凝膠，120v恒壓電泳20min，使用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

12、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了用于嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測的通用pcr引物組合，并建立了肺支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、溶神經(jīng)支原體、鼠支原體和希爾氏支原體五種嚙齒動(dòng)物易感支原體的通用pcr檢測方法，在具有高靈敏性的同時(shí)，不存在非特異性擴(kuò)增，兼具了準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法可提升臨床檢測效率，縮短臨床檢測周期，為嚙齒動(dòng)物支原體臨床檢測提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測方法。

技術(shù)特征：

1.一種用于嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測的通用pcr引物組合，所述引物組合為靶標(biāo)上游引物和下游引物，所述靶標(biāo)上游引物的核苷酸序列是seq?id?no.1：atagagatatagtggaggttaa；所述靶標(biāo)下游引物的核苷酸序列是seq?id?no.2：cccagtcaccagtcct。

2.權(quán)利要求1所述引物組合在檢測嚙齒動(dòng)物易感支原體方面的應(yīng)用，或在制備嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測試劑盒方面的應(yīng)用。

3.一種用于嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物組合。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dna聚合酶和dntp。

5.權(quán)利要求3所述試劑盒用于檢測嚙齒動(dòng)物易感支原體，所述支原體包括肺支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、溶神經(jīng)支原體、鼠支原體和希爾氏支原體。

6.一種肺支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、溶神經(jīng)支原體、鼠支原體和希爾氏支原體的通用pcr檢測方法，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通用pcr檢測方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：dna聚合酶15μl；2.5mm?dntp?2μl；25μm的靶標(biāo)上下游引物各0.25μl；樣品dna?1.5μl；超純水補(bǔ)至30μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通用pcr檢測方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，5min；95℃，30s，49℃～58℃，30s，72℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通用pcr檢測方法，其特征在于，凝膠成像步驟為：取pcr產(chǎn)物7.5μl，用2％瓊脂糖凝膠，120v恒壓電泳20min，使用凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于嚙齒動(dòng)物易感支原體檢測的通用PCR引物組合，包含靶標(biāo)引物上游和靶標(biāo)下游引物，并建立了肺支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、溶神經(jīng)支原體、鼠支原體和希爾氏支原體五種嚙齒動(dòng)物易感支原體的通用PCR檢測方法，在具有高靈敏性的同時(shí)，不存在非特異性擴(kuò)增，兼具了準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，可提升臨床檢測效率，縮短臨床檢測周期。

技術(shù)研發(fā)人員：琚存祥,田苗苗,蔡利東,楊慧欣,熊艷,李乃馨,趙靜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海藥康生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19