本技術(shù)涉及微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其是涉及一種hib固體培養(yǎng)基及其制備方法和b型流感嗜血桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、b型流感嗜血桿菌（haemophilus?influenzae?type?b,?hib）是一種常見的引起兒童嚴(yán)重感染的病原體，其主要致病因子是莢膜多糖（capsular?polysaccharide,?cps）。hib疫苗主要是通過將hib的莢膜多糖與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，形成結(jié)合疫苗，以增強(qiáng)免疫效果并提供長期保護(hù)。因此，高質(zhì)量的hib莢膜多糖對于疫苗的效力至關(guān)重要，這使得hib的發(fā)酵培養(yǎng)具有重要的意義。

2、在工業(yè)生產(chǎn)中，為了獲得高產(chǎn)量和高純度的hib莢膜多糖，必須優(yōu)化微生物的生長條件。目前，用于hib培養(yǎng)的培養(yǎng)基中通常會加入腦心浸液（brain?heart?infusion,?bhi），這是一種由動物組織制成的復(fù)合營養(yǎng)液，能夠?yàn)槲⑸锾峁┍匾陌被?、維生素和其他營養(yǎng)成分。然而，bhi作為動物源成分，存在一定的局限性。由于其生產(chǎn)過程中使用的原材料和工藝可能存在波動，導(dǎo)致最終產(chǎn)品中成分組成的不穩(wěn)定，這不僅會影響hib的生長效率，還可能影響到后續(xù)的莢膜多糖提取和純化過程。

3、更重要的是，在大規(guī)模生產(chǎn)莢膜多糖的過程中，bhi中的成分如核酸、細(xì)胞蛋白質(zhì)等可能會污染產(chǎn)物，特別是其中含有的一種名為內(nèi)毒素的脂多糖（lipopolysaccharide,lps），這種物質(zhì)的高度可變性（在尺寸、電荷、疏水性等方面）給純化帶來了極大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的純化方法往往復(fù)雜、耗時且成本高昂，并且在純化過程中可能會損傷珍貴的cps成分，降低其產(chǎn)率。此外，使用動物源性成分還存在著潛在的免疫原性改變風(fēng)險，這在疫苗制造中是一個不可忽視的問題。

4、鑒于上述原因，開發(fā)一種不含動物源成分、穩(wěn)定性好且能有效促進(jìn)hib生長的新型培養(yǎng)基，對于提高h(yuǎn)ib莢膜多糖的生產(chǎn)效率和質(zhì)量具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決當(dāng)前hib培養(yǎng)基中動物源成分對hib莢膜多糖純度、產(chǎn)率、免疫原性帶來的不利影響，本技術(shù)提供了一種不含腦心浸液的hib固體培養(yǎng)基及其制備方法和b型流感嗜血桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法。

2、第一方面，本技術(shù)提供一種hib固體培養(yǎng)基，包括：

3、酵母浸出粉1～3g/l、胰蛋白胨3～6g/l、氯化鈉3～6g/lg/l、無水磷酸氫二鈉0.5～1.5g/l、瓊脂粉25～35g/l、葡萄糖2～3g/l、nad?0.01～0.03g/l、氯化血紅素0.02～0.05g/l、5～10g/l滲透壓保護(hù)劑；所述滲透壓保護(hù)劑包括質(zhì)量比為1～2:1～2的?；撬崤c多元醇及其衍生物。

4、優(yōu)選的，所述多元醇及其衍生物包括丙二醇、丙三醇、丁二醇、糖醇中一種或幾種的組合物。

5、優(yōu)選的，所述糖醇包括山梨糖醇、甘露糖醇、?赤蘚糖醇、?麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇中的一種或幾種的組合物。

6、本技術(shù)中的固體培養(yǎng)基，能夠?qū)崿F(xiàn)與加入腦心浸液培養(yǎng)基相近的菌群生長速率，并在同等培養(yǎng)時間內(nèi)達(dá)到相近菌體濃度。具體的，本技術(shù)在培養(yǎng)基中增加了瓊脂用量，以降低固體培養(yǎng)基中游離水含量，提高菌體的氧氣和二氧化碳交換率，通過提高其代謝速率來補(bǔ)償菌體腦心浸液缺失對培養(yǎng)過程菌體生長速率下降的負(fù)面影響。同時，促進(jìn)莢膜多糖產(chǎn)量地提高。

7、需要說明的是，固體培養(yǎng)基中游離水含量的降低，也可能導(dǎo)致微生物脫水，從而減緩細(xì)菌生長。為此，本技術(shù)培養(yǎng)基中加入滲有透壓保護(hù)劑來維持菌體滲透壓的平衡，保持菌體細(xì)胞的完整性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的交換和代謝物質(zhì)的傳遞，保障菌體的生長速率。此外，上述加入的滲透壓保護(hù)劑分別能夠?yàn)榫w生長繁殖提供可快速利用的氮源和碳源，補(bǔ)償去除腦心浸液造成的營養(yǎng)成分缺失。

8、優(yōu)選的，所述多元醇采用質(zhì)量比為1:0.9～1.5的泛醇和丙三醇。

9、采用糖醇和丙三醇配伍的多元醇，一方面用其不同的分子結(jié)構(gòu)，起到更為優(yōu)異地平衡滲透壓的作用。其中，糖醇的親水性使其在維持細(xì)胞活性上作用較優(yōu)，而丙三醇的分子量較小，具有更高的生物可利用性，可作為更容易被菌群直接吸收和利用的碳源，支持菌群的快速生長和繁殖菌體的生長。具體而言。需要說明的是，本技術(shù)加入的滲透壓保護(hù)劑足夠多，能夠?qū)崿F(xiàn)上述多種功效。

10、第二方面，本技術(shù)提供一種固體培養(yǎng)基的制備方法，其采用上述任一所述固體培養(yǎng)基的原料配比，并按照如下步驟制得：

11、將酵母浸出粉、胰蛋白胨、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉按配方量加入水中，攪拌溶解后定容，調(diào)節(jié)ph值至7.2～7.4，得到預(yù)混液；

12、將瓊脂粉加入預(yù)混液中進(jìn)行煮沸溶解，充分溶解后分裝至克式瓶中進(jìn)行滅菌，得到滅菌培養(yǎng)基；優(yōu)選的，滅菌條件為溫度115～120℃，時間20～30min；

13、稱取葡萄糖、nad、氯化血紅素，葡萄糖和nad用水溶解后定容，氯化血紅素用5%的氨水進(jìn)行溶解，溶解后用水定容；

14、將葡萄糖、nad和氯化血紅素的溶液用無菌過濾器過濾除菌后加入滅菌培養(yǎng)基中混勻，凝固后進(jìn)行預(yù)孵即得。

15、優(yōu)選的，預(yù)孵條件為溫度35～37℃，時間70～75h。

16、優(yōu)選的，預(yù)孵結(jié)束后將培養(yǎng)基放入4～8℃冰箱中保存儲藏。

17、第三方面，本技術(shù)提供一種b型流感嗜血桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其包括：

18、一代培養(yǎng)：將菌液滴入hib固體培養(yǎng)基中，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，維持溫度35～37℃，二氧化碳濃度5±0.5%，培養(yǎng)16～24小時；其中，固體培養(yǎng)基為上述任一所述固體培養(yǎng)基或上述方法制備得到的固體培養(yǎng)基；

19、二代培養(yǎng)：取液體培養(yǎng)基溶液潤洗hib固體培養(yǎng)基上菌苔，用刮桿刮下固體培養(yǎng)基上的菌落，吸打均勻后轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中，再置于搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35～37℃，轉(zhuǎn)速100～300rpm，培養(yǎng)2～5小時；

20、三代培養(yǎng)：將液體培養(yǎng)基和二代液體菌種收獲液泵入20l發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中根據(jù)溶氧變化增加攪拌速度和空氣流量，將溶氧含量控制在20%±15%；培養(yǎng)2～6小時，當(dāng)20l發(fā)酵罐培養(yǎng)物生長到對數(shù)期時且od600nm處于0.6～1.2時結(jié)束；

21、發(fā)酵培養(yǎng)：將三代液體菌種收獲液轉(zhuǎn)移至裝有液體培養(yǎng)基的200l發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中根據(jù)溶氧變化增加攪拌速度和空氣流量，將溶氧含量控制在20%±15%；培養(yǎng)3～10小時，直至培養(yǎng)物od600nm值生長減慢或降低時，終止發(fā)酵培養(yǎng)。

22、優(yōu)選的，所述液體培養(yǎng)基包括：

23、酸水解酪蛋白5～10g/l、酵母浸出粉3～6g/l、磷酸二氫鈉一水合物1～2g/l、無水磷酸二氫鈉1～2g/l、乳酸鈉水溶液1～2ml/l、硫酸銨0.5～1.5g/l、l-胱氨酸0.01～0.05g/l、l-色氨酸0.01～0.05g/l、葡萄糖2～6g/l、nad?0.01～0.1g/l、氯化血紅素0.01～0.05g/l、無水氯化鈣0.01～0.03g/l、硫酸鎂1～2g/l。

24、上述液體培養(yǎng)基中通過加入葡萄糖和l-胱氨酸、l-胱氨酸，用以補(bǔ)償菌體生長所需的碳源與氮源。且試驗(yàn)表明，磷酸鹽的加入還有助于提高莢膜多糖產(chǎn)率，其原因可能在于，莢膜多糖組成中含有較多的核糖基磷酸醇磷酸鹽。

25、優(yōu)選的，三代培養(yǎng)中，通氣流量為2～10l/min；攪拌速度為100～300rpm；罐壓為0.01～0.03mpa；ph：6.5～7.5；溫度：36±1℃。

26、優(yōu)選的，四代培養(yǎng)中，通氣流量為4～40l/min；攪拌速度為100～600rpm；罐壓為0.01～0.03mpa；ph：6.5～7.5；溫度：36±1℃。

27、優(yōu)選的，增加攪拌速度和空氣流量控制溶氧含量時，每次增加5～10rpm攪拌速度或增加1～2l/min空氣流量。

28、提高培養(yǎng)液中的溶氧，可提高h(yuǎn)ib細(xì)菌的生長速率以及莢膜多糖的產(chǎn)量。上述增加攪拌速度或空氣流量目的在于增液體培養(yǎng)基中的溶解氧含量，在培養(yǎng)過程中溶氧含量下降時，可通過增加攪拌速度和/或增加空氣流量來增加溶氧含量，但在攪拌速度允許范圍內(nèi)，優(yōu)先考慮增加攪拌速度。

29、優(yōu)選的，培養(yǎng)開始后od檢查頻率為0小時取樣一次，每隔0～1小時取樣一次；取樣時間可根據(jù)實(shí)際發(fā)酵情況適當(dāng)調(diào)整。

30、本技術(shù)在操作階段通過持續(xù)的高轉(zhuǎn)速維持溶氧，有助于提高細(xì)菌的生長速率和培養(yǎng)效果。

31、綜上所述，本技術(shù)具有如下有益效果：

32、本技術(shù)通過去除傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的腦心浸液，提高了莢膜多糖成分質(zhì)量的穩(wěn)定性，降低了純化和提取難度，減少了免疫原性改變的風(fēng)險。同時，通過調(diào)整菌種培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中瓊脂用量，配合以特定滲透壓保護(hù)劑的應(yīng)用，有效彌補(bǔ)了腦心浸液缺位對細(xì)菌培養(yǎng)速率和效果的不良影響。