本技術(shù)涉及細(xì)胞核提取，更具體地說(shuō)，它涉及一種關(guān)于新鮮凍存組織的單細(xì)胞抽核方法。

背景技術(shù)：

1、自單細(xì)胞技術(shù)誕生以來(lái)，在各研究領(lǐng)域，如神經(jīng)科學(xué)、瘤異質(zhì)性、細(xì)胞分化、譜系追蹤、治療反應(yīng)、耐藥性、免疫方向、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等方面得到廣泛應(yīng)用。

2、單細(xì)胞(或單細(xì)胞核)測(cè)序技術(shù)以其單細(xì)胞分辨率、全轉(zhuǎn)錄組大規(guī)模的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，無(wú)偏差地展現(xiàn)了組織內(nèi)細(xì)胞類型異質(zhì)性圖譜，極大地推動(dòng)了各研究領(lǐng)域的發(fā)展。另外，單細(xì)胞開(kāi)放染色質(zhì)組技術(shù)，使得能夠從表觀遺傳學(xué)角度，對(duì)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異的分子機(jī)制進(jìn)行研究。

3、由于生物學(xué)是極其復(fù)雜的，科學(xué)家或者是研究人員一直在尋找一些新的方式方法以及技術(shù)試圖去了解生物學(xué)背后的一些機(jī)理，因此高分辨率的技術(shù)可以幫助科研人員去定義或者去發(fā)現(xiàn)這些異質(zhì)性細(xì)胞的群體，基于這些細(xì)胞群體，去發(fā)現(xiàn)新的一些細(xì)胞的標(biāo)志物，或者是相關(guān)的調(diào)控的通路，從而比較健康組織與患病組織之間的差異，為疾病的治療找到更好的方案，使單細(xì)胞有效應(yīng)用。

4、但是，在制備單細(xì)胞懸液時(shí)，在腦等組織消化的過(guò)程中會(huì)損失大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)因?yàn)樗枨时燃?xì)胞的直徑還小，通過(guò)篩網(wǎng)去除不掉，影響了細(xì)胞的檢出。

5、針對(duì)以上問(wèn)題，公開(kāi)號(hào)為2024103623192-一種基于高密度液體技術(shù)的小鼠腦組織細(xì)胞核提取方法，其通過(guò)裂解、過(guò)濾、離心、重懸等工藝，但該過(guò)程所用到提取輔助液中通常加入表面活性劑的溶液進(jìn)行輔助提取，由于表面活性劑的兩親性，使其能夠穿透細(xì)胞膜，并進(jìn)入至細(xì)胞內(nèi)部。一旦進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞核，產(chǎn)生損害，因此，容易導(dǎo)致裂解時(shí)間不易把控，對(duì)細(xì)胞核的損傷較大，同時(shí)清洗髓鞘碎片去除效率較低，得到的細(xì)胞核純度也較低，為此，需要進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了進(jìn)一步提高髓鞘碎片去除效率，同時(shí)減少對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行損壞，本技術(shù)提供一種關(guān)于新鮮凍存組織的單細(xì)胞抽核方法。

2、本技術(shù)提供的一種關(guān)于新鮮凍存組織的單細(xì)胞抽核方法，包括以下步驟：

3、1)將組織與lysis?buffer混合，靜置，使組織充分浸潤(rùn)，得到潤(rùn)濕物a；

4、2)將潤(rùn)濕物a進(jìn)行研磨裂解處理，使組織裂解，并釋放細(xì)胞核，得到裂解物b；

5、3)將裂解物b進(jìn)行吹打，過(guò)濾，得到的濾液記為濾液c；

6、4)將濾液c進(jìn)行離心處理，除去上清液，再向沉淀物中加入wash?buffer，吹打，重懸，得到重懸物d；

7、5)將重懸物d進(jìn)行離心處理，除去上清液，再向沉淀物中加入diluted?nucleicbuffer，重懸，得到重懸物e；

8、6)將重懸物e進(jìn)行離心處理，除去上清液，再向沉淀物中加入diluted?nucleicbuffer，重懸，吹打，得到細(xì)胞核懸液；

9、以5mllysis?buffer計(jì)，所述lysis?buffer包含：18-22mm?tris、24-26mm?kcl、4-6mm?mgcl2、240-260mm?sucrose、質(zhì)量濃度為0.8-1.2％?bsa、0.5-1u/μl?rnaseinhibitor，用h2o定容至5ml；

10、以5mlwash?buffer計(jì)，所述wash?buffer包含：質(zhì)量濃度為15-25％的50％optiprep、0.5-1u/μl?rnase?inhibitor，用h2o定容至5ml；

11、以5ml50％optiprep計(jì)，所述50％optiprep包含：質(zhì)量濃度為48-52％的60％optiprep、18-22mm?tris、24-26mm?kcl、4-6mm?mgcl2，用h2o定容至5ml。

12、上述方案中，本技術(shù)經(jīng)過(guò)潤(rùn)濕、研磨裂解、過(guò)濾、多次離心處理，將組織中的其他雜質(zhì)去除，提高細(xì)胞核的純度。

13、本技術(shù)的lysis?buffer和wash?buffer中均未含有表面活性劑，因此，在提取裂解和沖洗過(guò)程不易對(duì)細(xì)胞核造成損壞，而本技術(shù)采用的wash?buffer中采用的50％optiprep是通過(guò)basic?buffer進(jìn)行稀釋，能夠起到較佳的分離雜質(zhì)和細(xì)胞核，并對(duì)細(xì)胞核無(wú)過(guò)度刺激，而60％optiprep會(huì)對(duì)細(xì)胞核產(chǎn)生刺激，不利于細(xì)胞核提取。

14、其中，mm是體積摩爾濃度(即物質(zhì)的量濃度),指的是毫摩爾每升；u/μl是濃度單位，u/μl這個(gè)單位表示的是在每微升(μl)的溶液中所含有的生物活性單位(u)的數(shù)量。

15、tris是一種緩沖液，其其主要成分是三羥甲基氨基甲烷，tris的作用主要體現(xiàn)在維持待提取樣品裂解后釋放的rna和dna的穩(wěn)定性，和維持裂解液中的ph值，本技術(shù)的tris優(yōu)選為ph為7.8。

16、kcl、mgcl2的起到維持細(xì)胞的滲透壓平衡，同時(shí)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解和提取。sucrose為蔗糖，其作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，幫助維持細(xì)胞的滲透壓平衡，從而促進(jìn)細(xì)胞的裂解。abs為牛血清白蛋白，其主要起到保護(hù)酶的穩(wěn)定性和防止酶的分解及非特異性吸附。rnaseinhibitor為核糖核酸酶抑制劑，起到低細(xì)胞破碎過(guò)程中所釋放的rnase的活性。

17、通過(guò)18-22mm?tris、24-26mm?kcl、4-6mm?mgcl2、240-260mm?sucrose、質(zhì)量濃度為0.8-1.2％?bsa、0.5-1u/μl?rnase?inhibitor得到的lysis?buffer，起到較佳的裂解、滲透等作用，再配合研磨裂解過(guò)程，提高組織的裂解作用，使得能夠提高細(xì)胞核提取效率。

18、60％optiprep是質(zhì)量濃度為60％(w/v)的碘克砂醇溶液，通過(guò)利用18-22mm?tris、24-26mm?kcl、4-6mm?mgcl2，對(duì)其進(jìn)一步稀釋，得到的wash?buffer能夠起到較佳的分離組織中細(xì)胞核和髓鞘碎片的作用，對(duì)細(xì)胞核的刺激性少，容易使細(xì)胞核與其他雜質(zhì)分層，從起到較佳的除雜作用，并且能夠更大程度保護(hù)細(xì)胞核，提高細(xì)胞核提取純度和完整度。

19、lysis?buffer為lysis?buffer；wash?buffer為洗滌緩沖液；diluted?nucleicbuffer為稀釋核酸緩沖液。

20、綜上，通過(guò)本技術(shù)的潤(rùn)濕、研磨裂解、過(guò)濾、多次離心處理的處理工藝，再配合本技術(shù)得到的lysis?buffer、wash?buffer等，起到較佳的除雜和分離細(xì)胞核的作用。且本技術(shù)的lysis?buffer、wash?buffer中，不含表np40、tween-20等表面活性劑，因此，在裂解過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞核的損傷較小，能夠配合本技術(shù)的制備工藝，使細(xì)胞核完整的釋放出來(lái)，同時(shí)rna降解的概率大幅下降；在利用含質(zhì)量濃度為15-25％50％optiprep的wash?buffer，再結(jié)合本技術(shù)的離心處理工藝，使細(xì)胞核和雜質(zhì)分層，有利于高效去除雜質(zhì)和殘缺的細(xì)胞核，提高細(xì)胞核提取純度和完整度。

21、優(yōu)選的,以5mldiluted?nucleic?buffer計(jì)，所述diluted?nucleic?buffer包含：質(zhì)量濃度為0.8-1.2％?bsa、0.8-1.2u/μl?rnase?inhibitor，用h2o定容。

22、采用稀釋劑中含有質(zhì)量濃度為0.8-1.2％?bsa和0.8-1.2u/μl?rnase?inhibitor，能夠起到較佳的稀釋作用，再配合潤(rùn)濕、研磨裂解、過(guò)濾、多次離心處理的工藝，結(jié)合本技術(shù)配置得到wash?buffer和lysis?buffer，能夠?qū)⒔M織中的髓鞘碎片去除干凈，同時(shí)減少對(duì)細(xì)胞核的損害，提高細(xì)胞核的提取純度和完整性。

23、優(yōu)選的，所述步驟1)中的靜置時(shí)間為1.8-2.2min。

24、以上靜置時(shí)間能夠使lysis?buffer將組織充分潤(rùn)濕，便于后續(xù)進(jìn)行研磨時(shí)，容易將組織研磨成細(xì)小顆粒，便于組織發(fā)生裂解，提高細(xì)胞核的提取和除雜效率。

25、優(yōu)選的，所述步驟2)研磨裂解處理中，垂直研磨15-20次，靜置裂解1.5-2min。

26、經(jīng)過(guò)15-20次的垂直研磨，能夠?qū)⒔M織進(jìn)行研磨成微小的顆粒，進(jìn)而能夠使lysisbuffer充分與微小的顆粒接觸，從而促進(jìn)組織進(jìn)行裂解，使細(xì)胞核能夠完整分離，提高細(xì)胞核的提取品質(zhì)，并且有利于除去髓鞘碎片等雜質(zhì)，提高細(xì)胞核的提取純度。

27、優(yōu)選的，所述步驟3)中的吹打次數(shù)為10-15下，過(guò)濾的濾網(wǎng)網(wǎng)孔為30μm。

28、通過(guò)以上吹打次數(shù)，使得重懸物d的原料體系分散均勻，而通過(guò)選用30μm的濾網(wǎng)網(wǎng)孔，能夠更大程度除去去髓鞘碎片等雜質(zhì)，從而提高細(xì)胞核的提取純度和品質(zhì)。

29、優(yōu)選的，所述步驟3)的濾網(wǎng)在過(guò)濾前需要用lysis?buffer進(jìn)行潤(rùn)洗，過(guò)濾后，需要用lysis?buffer進(jìn)行沖洗濾網(wǎng)2-3次。

30、通過(guò)潤(rùn)洗，可以去除濾網(wǎng)上存在的雜質(zhì)或殘留物，確保濾網(wǎng)在使用時(shí)，不會(huì)因?yàn)檫@些雜質(zhì)而影響過(guò)濾效果，同時(shí)能夠保持濾網(wǎng)的活性，確保在正式過(guò)濾時(shí)，能夠有效地截留目標(biāo)物質(zhì)，還能避免交叉污染。而用lysis?buffer進(jìn)行沖洗濾網(wǎng)2-3次，能夠?qū)埩粲跒V網(wǎng)上細(xì)胞核沖洗干凈，提高細(xì)胞核的提取效率。

31、優(yōu)選的，所述步驟4)的離心處理?xiàng)l件為500g、4σc、5-6min、升9降9離心。

32、以上采用500g的離心力的度量，在4℃下進(jìn)行離心處理，離心時(shí)間為5-6min,再通過(guò)升9降9的離心機(jī)轉(zhuǎn)速變化模式，即開(kāi)始時(shí)離心機(jī)的轉(zhuǎn)速逐漸增加到最大值(升9)，然后在結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)速逐漸降低到最小值(降9)。以上條件能有助于提高分離效果，從而達(dá)到較佳的除雜效果。

33、優(yōu)選的，所述步驟5)的離心處理?xiàng)l件為800g、4℃、5-10min、升4降4離心。

34、經(jīng)過(guò)步驟4)的離心處理后，再次采用800g、4℃、5-10min、升4降4離心的離心條件，再結(jié)合wash?buffer的作用，能夠起到較佳的離心效果，從而有效將細(xì)胞核和雜質(zhì)分析，從而使細(xì)胞核達(dá)到較佳的除雜效果，并能夠更大程度保護(hù)細(xì)胞核的完整性。

35、優(yōu)選的，所述步驟6)的離心處理?xiàng)l件為500g、4℃、5-8min、升9降9離心。

36、再進(jìn)一步進(jìn)行離心處理。并經(jīng)過(guò)500g、4℃、5-8min、升9降9離心的離心條件，能夠起到較佳的離心分離效果，從而使細(xì)胞核達(dá)到較佳的除雜效果。

37、優(yōu)選的，所述組織為腦、脂肪、胎盤、脊髓、心臟中的一種。

38、本技術(shù)的一種關(guān)于新鮮凍存組織的單細(xì)胞抽核方法能夠用于各種組織中細(xì)胞的提取，如腦、脂肪、胎盤、脊髓、心臟等組織中的細(xì)胞核提取。并起到較佳的提取效果。

39、綜上所述，本技術(shù)具有以下有益效果：

40、通過(guò)本技術(shù)的潤(rùn)濕、研磨裂解、過(guò)濾、多次離心處理的處理工藝，再配合本技術(shù)得到的lysis?buffer、wash?buffer等，起到較佳的除雜和分離細(xì)胞核的作用。且本技術(shù)的lysis?buffer、wash?buffer中，不含表np40、tween-20等表面活性劑，因此，在裂解過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞核的損傷較小，能夠配合本技術(shù)的制備工藝，使細(xì)胞核完整的釋放出來(lái)，同時(shí)rna降解的概率大幅下降；在利用含質(zhì)量濃度為15-25％50％optiprep的wash?buffer，再結(jié)合本技術(shù)的離心處理工藝，使細(xì)胞核和雜質(zhì)分層，有利于高效去除雜質(zhì)和殘缺的細(xì)胞核，提高細(xì)胞核提取純度和完整度。